【摘 要】
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PCR介导的基因置换技术是一种利用λ噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法。实验利用该方法快速构建基因中断载体,并成功地置换了阿维链霉菌(Streptomyces averm
【机 构】
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华中农业大学农业微生物国家重点实验室,北京生物医药研究所
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PCR介导的基因置换技术是一种利用λ噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法。实验利用该方法快速构建基因中断载体,并成功地置换了阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)bkdF基因。先合成1对长度分别为58和59nt的引物,其5’端的39nt序列分别与bkdF基因两侧同源,3’端则分别与安普霉素抗性标记盒(aac(3)Ⅳ+oriT)两侧序列一致。以该引物扩增的PC R产物电转化能表达λRed重组酶且含有目标质粒的大肠杆菌(Escherichia.coli)菌株B W25113/pIJ790/pX W1224,获得了阳性重组质粒pX W1230。将该质粒中的大小为4.0kb B glⅡ目的片段插入基因置换载体pH Z1351,再接合转移至阿维链霉菌B JBM9903,筛选得到表型为ApraRThioS的接合子。PCR验证并对发酵产物进行H PLC和MS分析,证实该接合子为bkdF-突变株。
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