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背景:以往研究已证明胚胎干细胞可被诱导分化为胰岛素分泌细胞,但诱导时间较长,大部分需要1个月左右。目的:体外联合应用激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺4种生长因子,观察能否在较短的时间内将小鼠胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。设计:细胞观察实验。单位:上海市内分泌及代谢病研究所,上海交通大学医学院附属瑞金医院。材料:实验于2004-10/2006-02在上海市内分泌研究所完成。清洁级孕12.5~14.5d龄昆明小白鼠2只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供,动物质量合格证号2004A034,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。小鼠胚胎干细胞株由法国里昂CNRSUMR5641实验室张昌贤教授提供。激活素A为R&D公司产品;全反式维甲酸,烟酰胺由Sigma公司提供;碱性成纤维细胞生长因子由Gibco公司提供。方法:取孕鼠胚胎,除去头部和内脏,将剩余组织剪碎,胰酶消化后制备细胞悬液,取上层离心重悬,按3×108L-1接种培养,传2~3代时作为滋养层细胞。将鼠胚胎干细胞接种到新鲜滋养层上,加入含白血病抑制因子的knockoutDMEM培养基,常规培养两三天后按1∶3~1∶6传代,当细胞与细胞之间分开时加入含血清的培养液终止消化,离心弃上清,制成单细胞悬液按2.5×104密度接种,加入不含白血病抑制因子的培养液,24~48h后收集形成的胚胎体,铺于Matrigel铺底的培养皿中。胚胎体贴壁后,在含有100μg/L激活素的10%FBS/DMEM中培养24h,再将培液换为10%FBS/DMEM培养6~8h作为间隔,然后把分化的胚胎体在含10-6mol/L全反式维甲酸的10%FBS/DMEM中培养24h,在含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的10%FBS/DMEM中培养3~5d,在含N2、B27、1μg/L层粘连蛋白、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10mmol/L烟酰胺的DMEM/F12培液中培养3~5d。诱导结束后,采用双硫腙染色、免疫荧光染色、RT-PCR检测分化细胞胰岛素的表达。主要观察指标:①胚胎干细胞的诱导情况。②双硫腙染色及免疫荧光染色。③RT-PCR检测。结果:①滋养层上的小鼠胚胎干细胞呈集落状态贴壁生长,集落边缘清晰,细胞之间的界限不明显。胚胎体形成后转至matrigel板上2d即贴壁。激活素A和全反式维甲酸间歇诱导后,碱性成纤维细胞生长因子培液中的细胞大部分变为上皮细胞样;经含N2、B27、层粘连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、烟酰胺的DMEM/F12培液作用后,细胞形成小的簇状结构。②诱导生成的胰岛素分泌细胞经双硫腙染色呈暗红色,免疫荧光染色呈红色,均为阳性反应。③经激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、烟酰胺四种生长因子诱导2周后,分化细胞不表达Insulin 1 mRNA,表达Insulin 2,Pdx1,Nkx6.1,Nkx2.2,PP,IAPP,Glut2,Somastatin,Hnf3β及Neuro D mRNA。结论:体外联合应用激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺4种生长因子,能够将小鼠胚胎干细胞成功诱导分化为胰岛素分泌细胞,且诱导时间缩短至2周。