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摘要：目的：分析呼吸道合胞病毒对小鼠肾小球足细胞TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP分子表达的影响。方法：培养小鼠足细胞系，用于研究实验。将分化成熟的肾小球足细胞分为对照组和观察组，在观察组细胞培养液中加入不同MOI（感染复数）的呼吸道合胞病毒干预，对照组为常规培养，干预24、48、72小时后，观察小鼠肾小球足细胞的形态，采用图像处理软件分析各组肾小球足细胞的形态差异，采用RT-PCR、western-blot检测小鼠肾小球足细胞TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP的分子表达情况。结果：常规培养条件下两组肾小球足细胞TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP具有一定量的分子表达，对观察组肾小球足细胞实施呼吸道合胞病毒干预后，观察组肾小球足细胞的nephrin、podocin和CD2AP表达量明显下降，TRPC6明显增高，且均存在剂量效应（P<0.05）。结论：呼吸道合胞病毒影响小鼠肾小球足细胞裂孔膜相关蛋白表达，导致蛋白尿形成。
关键词：呼吸道合胞病毒；足细胞；小鼠肾小球；影响
呼吸道合胞病毒是一种RNA病毒，在临床上属于副粘液病毒科，主要通过空气飞沫和密切接触传播。微小病变型肾病综合征（MCN）S是儿童肾病综合征的最常见类型，临床上多表现为单纯性肾病综合征（SNS），超微结构显示肾小球脏层上皮细胞足突肿胀、融合。足细胞，特别是足突间的裂孔膜现在被认为是肾小球滤过屏障中最重要的成分，TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP是足细胞裂孔膜的重要分子组成部分[1]。既往研究表明，呼吸道病毒在（MCN）S的发生、发展过程中起了重要作用，但其具体分子机制尚不明确。而足细胞的裂孔膜被认为是蛋白尿发生的最关键结构，故我院首次针对呼吸道合胞病毒对小鼠肾小球足细胞裂孔膜分子表达的影响进行了研究。现将研究结果报告如下：
1.材料与方法
1.1材料
RSV 长株由广州呼吸疾病研究所免费馈赠。永生型小鼠足细胞系（mouse podocyte clone 5，MPC5）美国 Mundel 教授授权，北京大学第一医院儿科丁洁教授转赠。
1.2实验方法
1.2.1呼吸道合胞病毒的准备 呼吸道活病毒长株接种于 Hep-2单细胞层，以含 20 g/L胎牛血清的RPM I 1640为培养液，于 37℃传代至 80% 以上的细胞发生病变，收集细胞，低温超声破碎细胞，4℃条件下离心 2 000 转/分，10 分钟，收集上清，通过空斑实验测定病毒滴度[4]，分装保存于液氮罐中备用。
1.2.2 MPC5培养 复苏MPC5细胞，于33℃培养箱中增殖培养，平均3～4天细胞增殖至培养瓶底达80%，传代，置于37℃中培养，约10～14天分化成熟，用于实验。
1.2.3病毒感染 将1x106的足细胞接种于6孔板中过夜，然后用不同感染复数（multiplicityofinfection，MOI）的RSV病毒感染细胞。MOI是指病毒感染单位数与细胞数的比值。分别以MOI为0.05、0.5、1的RSV感染足细胞24h、48h、72h，采用倒置显微镜观察小鼠足细胞的形态变化，并去除上清后收集细胞，抽提蛋白及mRNA[5]。
1.2.4 RT-PCR RT-PCR扩增引物序列如下：nephrin正反义引物：5’-CGGAGAAGACTGAGGCGC-3’，5’- TCACACCAGATGTCCCCTCAG-3’；podocin：5’-TCTTGTCCTCTCCTCCCTGA-3’，5’-AGACGGAGGTCAACCTTGTG-3’；CD2AP：5'-GAAGGCGGAAGACAGAGATA-3'，5'-TTGGAGGTGGAGGAGGAACT-3’，β-actin：5' –TACAGCTTCACCACCACAGC-3'，5' -AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG - 3'。通过RT-PCR反应获得相应产物后再以凝胶电泳，Image tool进行图像处理，目的基因吸光度/内参β-actin吸光度为目的基因的半定量值。
1.2.5 western-blot 每个样品取 30 μg 蛋白进行电泳、转膜，加入一抗、二抗孵育后，显色，曝光、显影和定影。使用图像分析系统测定相对 A 值，目的蛋白条带/β - actin蛋白条带的灰度值表示目的蛋白相对含量。
1.3统计学分析
我院本次研究实验过程中，所得数据均采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用 ±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用 LSD-t 检验，P<0.05代表差异具有统计学意义。
2.结果
2.1足细胞形态变化
相差显微镜下观察，对照组足细胞分化良好，呈星形，细胞体和细胞核较增殖态细胞显著增大，细胞体上伸出树枝样突起，相邻细胞间形成相互连接。实验组于RSV刺激24 h后，即出现足突回缩，胞体面积缩小，部分足细胞出现足突消失及失去细胞间连接。MOI0.05、0.5、1组足细胞面积分别为对照组的75%、63%、52%，刺激48h后，面积缩小为对照组66%、56%、41%。刺激72小时后，面积分别缩小58%、47%、40%。以上结果差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.2 不同时间段TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP的mRNA及蛋白表达量的变化
正常培养情况下，两组组肾小球足细胞分子具有正常表达量，且表达量不存在明显差异（P>0.05）。对实验组肾小球足细胞实施呼吸道合胞病毒干预24h后，MOI0.05RSV感染的肾小球足细胞TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP的mRNA表达量均变化不明显，干预48h、72h后开始出现TRCP6表达增加，其余分子表达降低。MOI0.5及MOI1组在RSV干预24h开始较对照组有明显变化，TRCP6增高，nephrin、podocin和CD2AP降低，有统计学意义（P<0.05）。结果详见表1-表4。 3.讨论
肾病综合征的最基本的病变为蛋白尿，临床医学研究表明，肾小球性尿蛋白与肾小球过滤屏障结构的功能异常存在密切关系[6]，肾小球过滤屏障主要包括三层，分别为内皮细胞窗口、肾小球基底膜以及足细胞足突之间的裂孔隔膜，其中最后一层为肾小球过滤功能的重要部分。近些年来医学临床先后确定了多个定位于肾小球裂口隔膜的足细胞，如TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP[7-9]等，这些足细胞分子共同组成了一个信号传导复合物，维持肾小球过滤层的完整性，这些足细胞分子如果遭到破环，那么就会导致蛋白尿的生成[1]。
我院本次研究结果表明，呼吸道合胞病毒处理后的小鼠肾小球足细胞nephrin、podocin和CD2AP分子表达较处理前明显下降，TRPC6增高（P<0.05）。既往文献表明nephrin、podocin和CD2AP是裂孔隔膜复合体的最关键组成分子，它们的表达减少将影响肾小球滤过膜的完整性及局部信号传递，加速细胞的凋亡。TRCP6的增高可导致钙离子内流增加而损伤足细胞。所以本研究结果表明呼吸道合胞病毒可影响小鼠肾小球足细胞的分子表达，损伤足细胞，诱导其凋亡，从而导致蛋白尿的生成。
呼吸道合胞病毒是目前医学临床研究比较多的人类呼吸道病毒，越来越多临床研究证明：呼吸道病毒感染可能是MCNS的主要触发因素[2-3]。吴瑾[10]在研究中证实微小病变型肾病综合征（SRSNS）活动期能够在尿液及肾脏穿刺活检标本中检测到呼吸道病毒基因及呼吸道病毒抗原，说明呼吸道病毒可能直接作用于肾脏组织，影响肾小球结构及功能。而足细胞是肾小球滤过膜的最关键屏障，足细胞结构及功能的破坏是蛋白尿生成的最根本原因。本研究证实了呼吸道合胞病毒对肾小球足细胞裂孔膜相关蛋白的表达有明显的影响，且随着呼吸道病毒浓度的增高，这种影响程度越高。在病毒感染的前72小时，呼吸道合胞病毒对足细胞的作用逐步增强。这就为呼吸道合胞病毒感染后出现蛋白尿的原因提供了新的理论依据。为我们进一步研究MCNS的发病机制提供了新的方向，为其治疗提供了新的靶点。
总之，本实验证实了呼吸道合胞病毒能够影响小鼠肾小球足细胞的形态，影响裂孔膜相关蛋白的表达，是蛋白尿形成的关键病因之一。
参考文献：
[1]Shih NY，Li J，KarpitskiiV，et al.Congenital nephrotic syndrome in mice lacking CD2-associated protein[J].Science，1999，286（5438）：312-315.
[2].HabibR，Kleineehte，etal.hTePrimayrnePhrotiesyndromeofehildhood：elassiifeationandelinieoPahtologiesutdyof406eases.Path01Alln，1971：6：417-424.
[3]MacdonaldNE，NomranMD，etal.RoleofresPiratoyrviursesinexaeehtationsofPirmayrnePhrotiesyndrome.JPediratr，1986；108：378一382.
[4]McKimm-Breschkin JL.A simplified plaque assay for respiratorysyncytial virus-direct visualization of plaques withoutimmunostaining[J].J Virol Methods，2004，120（1）：113-117.
[5]王彦江，谢席胜，王宝福，冯胜刚.足细胞TRPC6与糖尿病肾病蛋白尿发生机制的研究新进展[J].中国中西医结合肾病杂志，2012，08（11）：747-749.
[6].RaatsCJ，VanDenBomJ，BerdenJH.GlomeurlarheParansulfatealtemat on：MechanismsandrelevaneeforProteinuria.KidneyInt，2000：57：385一400.
[7]Reiser J，Polu KR，Moller CC，et al.TRPC6 is a glomerular slit diaphragm-associated channel required for normal renal function.Nat Genet，2005，37：739-744.
[8]Moller CC，Wei C，Altintas MM，et al.Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease，J Am Soc Nephrol，2007，18：29-36.
[9]Brummelkamp TR，Bemards R，Agami R，et al. A system for stable expression short interfering RNAi in mammalan cells.Science，2002，296：550-553.
[10]吴瑾，王铮.呼吸道病毒基因及抗原在激素敏感型单纯性肾病综合征肾组织和尿液的表达[J]四川大学学报（医学版），2007，38（6）：969 - 972.
作者简介：彭亮，1982年3月生，湖南娄星区人，女，硕士，主治医师，主要研究方向为慢性肾脏病，钙磷代谢。
资助基金：湖南省科技计划项目2014sk3160；娄底市科技计划项目 娄财企指[2012]56
关键词：呼吸道合胞病毒；足细胞；小鼠肾小球；影响
呼吸道合胞病毒是一种RNA病毒，在临床上属于副粘液病毒科，主要通过空气飞沫和密切接触传播。微小病变型肾病综合征（MCN）S是儿童肾病综合征的最常见类型，临床上多表现为单纯性肾病综合征（SNS），超微结构显示肾小球脏层上皮细胞足突肿胀、融合。足细胞，特别是足突间的裂孔膜现在被认为是肾小球滤过屏障中最重要的成分，TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP是足细胞裂孔膜的重要分子组成部分[1]。既往研究表明，呼吸道病毒在（MCN）S的发生、发展过程中起了重要作用，但其具体分子机制尚不明确。而足细胞的裂孔膜被认为是蛋白尿发生的最关键结构，故我院首次针对呼吸道合胞病毒对小鼠肾小球足细胞裂孔膜分子表达的影响进行了研究。现将研究结果报告如下：
1.材料与方法
1.1材料
RSV 长株由广州呼吸疾病研究所免费馈赠。永生型小鼠足细胞系（mouse podocyte clone 5，MPC5）美国 Mundel 教授授权，北京大学第一医院儿科丁洁教授转赠。
1.2实验方法
1.2.1呼吸道合胞病毒的准备 呼吸道活病毒长株接种于 Hep-2单细胞层，以含 20 g/L胎牛血清的RPM I 1640为培养液，于 37℃传代至 80% 以上的细胞发生病变，收集细胞，低温超声破碎细胞，4℃条件下离心 2 000 转/分，10 分钟，收集上清，通过空斑实验测定病毒滴度[4]，分装保存于液氮罐中备用。
1.2.2 MPC5培养 复苏MPC5细胞，于33℃培养箱中增殖培养，平均3～4天细胞增殖至培养瓶底达80%，传代，置于37℃中培养，约10～14天分化成熟，用于实验。
1.2.3病毒感染 将1x106的足细胞接种于6孔板中过夜，然后用不同感染复数（multiplicityofinfection，MOI）的RSV病毒感染细胞。MOI是指病毒感染单位数与细胞数的比值。分别以MOI为0.05、0.5、1的RSV感染足细胞24h、48h、72h，采用倒置显微镜观察小鼠足细胞的形态变化，并去除上清后收集细胞，抽提蛋白及mRNA[5]。
1.2.4 RT-PCR RT-PCR扩增引物序列如下：nephrin正反义引物：5’-CGGAGAAGACTGAGGCGC-3’，5’- TCACACCAGATGTCCCCTCAG-3’；podocin：5’-TCTTGTCCTCTCCTCCCTGA-3’，5’-AGACGGAGGTCAACCTTGTG-3’；CD2AP：5'-GAAGGCGGAAGACAGAGATA-3'，5'-TTGGAGGTGGAGGAGGAACT-3’，β-actin：5' –TACAGCTTCACCACCACAGC-3'，5' -AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG - 3'。通过RT-PCR反应获得相应产物后再以凝胶电泳，Image tool进行图像处理，目的基因吸光度/内参β-actin吸光度为目的基因的半定量值。
1.2.5 western-blot 每个样品取 30 μg 蛋白进行电泳、转膜，加入一抗、二抗孵育后，显色，曝光、显影和定影。使用图像分析系统测定相对 A 值，目的蛋白条带/β - actin蛋白条带的灰度值表示目的蛋白相对含量。
1.3统计学分析
我院本次研究实验过程中，所得数据均采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用 ±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用 LSD-t 检验，P<0.05代表差异具有统计学意义。
2.结果
2.1足细胞形态变化
相差显微镜下观察，对照组足细胞分化良好，呈星形，细胞体和细胞核较增殖态细胞显著增大，细胞体上伸出树枝样突起，相邻细胞间形成相互连接。实验组于RSV刺激24 h后，即出现足突回缩，胞体面积缩小，部分足细胞出现足突消失及失去细胞间连接。MOI0.05、0.5、1组足细胞面积分别为对照组的75%、63%、52%，刺激48h后，面积缩小为对照组66%、56%、41%。刺激72小时后，面积分别缩小58%、47%、40%。以上结果差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.2 不同时间段TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP的mRNA及蛋白表达量的变化
正常培养情况下，两组组肾小球足细胞分子具有正常表达量，且表达量不存在明显差异（P>0.05）。对实验组肾小球足细胞实施呼吸道合胞病毒干预24h后，MOI0.05RSV感染的肾小球足细胞TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP的mRNA表达量均变化不明显，干预48h、72h后开始出现TRCP6表达增加，其余分子表达降低。MOI0.5及MOI1组在RSV干预24h开始较对照组有明显变化，TRCP6增高，nephrin、podocin和CD2AP降低，有统计学意义（P<0.05）。结果详见表1-表4。 3.讨论
肾病综合征的最基本的病变为蛋白尿，临床医学研究表明，肾小球性尿蛋白与肾小球过滤屏障结构的功能异常存在密切关系[6]，肾小球过滤屏障主要包括三层，分别为内皮细胞窗口、肾小球基底膜以及足细胞足突之间的裂孔隔膜，其中最后一层为肾小球过滤功能的重要部分。近些年来医学临床先后确定了多个定位于肾小球裂口隔膜的足细胞，如TRPC6、nephrin、podocin和CD2AP[7-9]等，这些足细胞分子共同组成了一个信号传导复合物，维持肾小球过滤层的完整性，这些足细胞分子如果遭到破环，那么就会导致蛋白尿的生成[1]。
我院本次研究结果表明，呼吸道合胞病毒处理后的小鼠肾小球足细胞nephrin、podocin和CD2AP分子表达较处理前明显下降，TRPC6增高（P<0.05）。既往文献表明nephrin、podocin和CD2AP是裂孔隔膜复合体的最关键组成分子，它们的表达减少将影响肾小球滤过膜的完整性及局部信号传递，加速细胞的凋亡。TRCP6的增高可导致钙离子内流增加而损伤足细胞。所以本研究结果表明呼吸道合胞病毒可影响小鼠肾小球足细胞的分子表达，损伤足细胞，诱导其凋亡，从而导致蛋白尿的生成。
呼吸道合胞病毒是目前医学临床研究比较多的人类呼吸道病毒，越来越多临床研究证明：呼吸道病毒感染可能是MCNS的主要触发因素[2-3]。吴瑾[10]在研究中证实微小病变型肾病综合征（SRSNS）活动期能够在尿液及肾脏穿刺活检标本中检测到呼吸道病毒基因及呼吸道病毒抗原，说明呼吸道病毒可能直接作用于肾脏组织，影响肾小球结构及功能。而足细胞是肾小球滤过膜的最关键屏障，足细胞结构及功能的破坏是蛋白尿生成的最根本原因。本研究证实了呼吸道合胞病毒对肾小球足细胞裂孔膜相关蛋白的表达有明显的影响，且随着呼吸道病毒浓度的增高，这种影响程度越高。在病毒感染的前72小时，呼吸道合胞病毒对足细胞的作用逐步增强。这就为呼吸道合胞病毒感染后出现蛋白尿的原因提供了新的理论依据。为我们进一步研究MCNS的发病机制提供了新的方向，为其治疗提供了新的靶点。
总之，本实验证实了呼吸道合胞病毒能够影响小鼠肾小球足细胞的形态，影响裂孔膜相关蛋白的表达，是蛋白尿形成的关键病因之一。
参考文献：
[1]Shih NY，Li J，KarpitskiiV，et al.Congenital nephrotic syndrome in mice lacking CD2-associated protein[J].Science，1999，286（5438）：312-315.
[2].HabibR，Kleineehte，etal.hTePrimayrnePhrotiesyndromeofehildhood：elassiifeationandelinieoPahtologiesutdyof406eases.Path01Alln，1971：6：417-424.
[3]MacdonaldNE，NomranMD，etal.RoleofresPiratoyrviursesinexaeehtationsofPirmayrnePhrotiesyndrome.JPediratr，1986；108：378一382.
[4]McKimm-Breschkin JL.A simplified plaque assay for respiratorysyncytial virus-direct visualization of plaques withoutimmunostaining[J].J Virol Methods，2004，120（1）：113-117.
[5]王彦江，谢席胜，王宝福，冯胜刚.足细胞TRPC6与糖尿病肾病蛋白尿发生机制的研究新进展[J].中国中西医结合肾病杂志，2012，08（11）：747-749.
[6].RaatsCJ，VanDenBomJ，BerdenJH.GlomeurlarheParansulfatealtemat on：MechanismsandrelevaneeforProteinuria.KidneyInt，2000：57：385一400.
[7]Reiser J，Polu KR，Moller CC，et al.TRPC6 is a glomerular slit diaphragm-associated channel required for normal renal function.Nat Genet，2005，37：739-744.
[8]Moller CC，Wei C，Altintas MM，et al.Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease，J Am Soc Nephrol，2007，18：29-36.
[9]Brummelkamp TR，Bemards R，Agami R，et al. A system for stable expression short interfering RNAi in mammalan cells.Science，2002，296：550-553.
[10]吴瑾，王铮.呼吸道病毒基因及抗原在激素敏感型单纯性肾病综合征肾组织和尿液的表达[J]四川大学学报（医学版），2007，38（6）：969 - 972.
作者简介：彭亮，1982年3月生，湖南娄星区人，女，硕士，主治医师，主要研究方向为慢性肾脏病，钙磷代谢。
资助基金：湖南省科技计划项目2014sk3160；娄底市科技计划项目 娄财企指[2012]56