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摘要 目的：運用网络药理学及分子对接分析交泰丸治疗心律失常的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）与BATMAN数据库检索黄连、肉桂的活性成分和靶基因，利用GeneCards数据库检索得到与心律失常相关的靶基因，采用Cytoscape软件绘制交泰丸的“活性成分-作用靶点”网络图，采用STRING数据库构建交泰丸治疗心律失常的蛋白质-蛋白质相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）网络图，将PPI网络图导入Cytoscape，采用DAVID数据库对药物-疾病交集靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路富集分析，使用Autodock Vina和Pymol进行分子对接。结果：共收集到交泰丸31个有效成分及其556个成分靶点;心律失常相关靶点2 205个;药物成分和疾病的共有靶点174个;使用Cytoscape拓扑分析得到小檗浸碱、表小檗碱、黄藤素、黄柏酮、小檗碱等20个核心成分，PPI网络得到ALB、AKT1、MAPK3、VEGFA、SRC等15个关键核心靶点。生物信息学富集分析中共获取821个GO条目，109条KEGG通路，主要涉及PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路、甲状腺激素信号通路、HIF-1信号通路等。分子对接结果表明，度值排名前5的主要活性成分与核心靶点（ALB、AKT1、MAPK3、VEGFA、SRC）有较强的亲和力。结论：该研究揭示了交泰丸可能通过调控细胞代谢、降低氧化刺激、改善血管重塑等方面治疗心律失常，为后续研究交泰丸治疗心律失常提供一定的中药药理依据。
关键词 交泰丸;心律失常;网络药理学;分子对接;中药药理;作用机制
Abstract Objective：To analyze the action mechanism of Jiaotai Pills in the treatment of arrhythmia by network pharmacology and molecular docking.Methods：The active components and their target genes of Rhizoma Coptidisn（黄连） and Cortex Cinnamomi（肉桂） were obtained through TCMSP platform and BATMAN database，GeneCards database retrieval were used to get the target genes associated with arrhythmia.Cytoscape software was used to draw “active ingredient-action target ” network graph.The STRING database was used to construct protein-protein interaction（PPI） network diagram of Jiaotai Pills in the treatment of arrhythmia.PPI network diagram was imported into Cytoscape.The DAVID database was used to perform GO（Gene Ontology） function and KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes） pathway enrichment analysis on drug-disease intersection targets，and Autodock Vina and Pymol were used for molecular docking.Results：A total of 31 active components and 556 component targets of Jiaotai Pills were collected.There were 2 205 targets related to arrhythmia; 174 drug and disease intersection targets were obtained; The Cytoscape topological analysis was used to obtain 20 core components such as berlambin，epiberberine，palmatine，obacunone，berberine and etc.and PPI network was used to obtain 15 core targets such as ALB，AKT1，MAPK3，VEGFA，SRC.A total of 821 GO terms and 109 KEGG pathways were obtained through bioinformatics enrichment analysis，mainly involving PI3K-AKT signaling pathway，Rap1 signaling pathway，cAMP signaling pathway，thyroid hormone signaling pathway，HIF-1 signaling pathway，etc.The results of molecular docking showed that the main active components had strong affinity with the core target（ALB，AKT1，MAPK3，VEGFA，SRC）.Conclusion：This study revealed the mechanism of Jiaotai Pills in the treatment of arrhythmia by regulating cellular metabolism，reducing oxidative stress，improving vascular remodeling，providing some pharmacological basis for the follow-up study on the treatment of arrhythmia by Jiaotai Pills. Keywords Jiaotai Pills; Arrhythmia; Network pharmacology; Molecular docking; Pharmacology of Chinese medicine; Mechanism of action
中图分类号：R285.6，R541.7文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.13.006
心律失常是指心脏节律的紊乱，主要有不规则心率、异常快速心率（心动过速）和异常慢速心率（心动过缓）3种表现[1]，临床上本病既可单独发病，又可同时伴发其他心血管疾病，具有发病率高及病情复杂等特点[2]，甚至危及生命。据中国心源性猝死流行病学调查显示，我国每年因心源性猝死患者可达54.4万例，其中80%以上是由恶性心律失常引起的[3]。目前在治疗方面，临床上多采用西药治疗，作用机制虽明确，但有“再致心律失常”的风险。在临床实践中，中药可通过多途径、多靶点等方向治疗疾病，疗效较为显著。
交泰丸是临床中治疗心悸的常用经典方剂，此方源自明·韩懋《韩氏医通》，主要用于治疗“心肾不交，怔忡不寐”，方由黄连、肉桂两味药物组成，黄连苦寒入心经，擅降心火不使其炎上，肉桂辛热入肾经，擅暖水脏不使其润下，二者寒温并用，水火既济，亦有泻南补北、交通心肾之妙[4]。因其组方独特，疗效显著，被后世临床治疗心悸广泛配合应用[5]。有研究报道使用交泰丸加味治疗室性早搏68例，早搏症状消失共计50例，症状明显好转有14例，总有效率达94%[6]。许凤云等[7]观察交泰丸对心血管系统的影响，结果显示交泰丸在增加耐缺氧能力、降压、增加冠脉流量及改善急性心肌缺血所引起的心电图的变化等方面效果较佳。
网络药理学是基于系统生物学的理论，融合多向药理学、生物信息学、计算机科学等多学科内容和技术，通过多种数据库进行网络分析，建立可視化网络关系图，从分子层面和整体角度对药物活性成分、作用靶点以及疾病的靶点蛋白进行分析，预测其作用机制[8-9]。目前临床对于交泰丸治疗心律失常的作用机制研究较少，本研究拟通过网络药理学技术，构建交泰丸成分-靶点-疾病网络进行分析，以探究其物质基础及治疗心律失常的作用机制，为后续研究提供有效的药理学依据。
1 资料与方法
1.1 交泰丸靶点收集
通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）与BATMAN数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），分别检索黄连、肉桂的活性成分。TCMSP平台筛选条件为口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18，BATMAN数据库设定为Score≥20进行筛选。通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取活性成分化学结构，保存Smile号，随后将Smile号上传至Swiss Target Prediction数据库，以“人类”为研究物种，进行相关活性成分的靶点预测，最后得到交泰丸活性成分及其作用的靶点。
1.2 心律失常靶点收集
通过GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）筛选治疗心律失常的相关靶点，以“arrhythmia”为关键词进行检索，筛选收集心律失常相关基因靶点。
1.3 活性成分-作用靶点网络图的绘制
选取活性成分作用靶点和疾病靶点的交集靶点，利用Cytoscape软件绘制活性成分-作用靶点网络图，使用Network Analyzer分析功能对网络图进行计算，根据结果筛选出核心活性成分。
1.4 核心蛋白的收集
通过STRING平台（https：//string-db.org）对交集靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）网络的绘制，将PPI信息导入Cytoscape中，对蛋白网络进行模块化聚类处理，通过Network Analyzer计算得出核心蛋白。
1.5 GO和KEGG富集分析
利用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov）对交集靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，设定阈值P≤0.5，选择生物过程（Biological Process，BP）、细胞成分（Cell Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3个模块进行GO富集分析，通路分析选择KEGG，并将得到的数据进行可视化，构建其排名前15个条目的气泡图。
1.6 分子对接
将“活性成分-作用靶点”网络图中节点度值最高的5个活性成分与PPI网络中节点度值最高的5个核心蛋白进行分子对接，验证其相互作用强度，活性成分结构通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取，蛋白质结构通过PDB数据库（http：//www.rcsb.org）获取。随后使用AutoDock Vina软件进行分子对接，借助Pymol软件对对接结果进行优化制图。
2 结果
2.1 交泰丸活性成分及其靶点获取
通过TCMSP平台以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，BATMAN数据库设定为Score≥20进行筛选，收集到活性成分31个，其中黄连14个、肉桂17个。见表1。通过Swiss Target Prediction数据库对活性成分进行靶点预测，共得到556靶点基因。 2.2 心律失常靶点获取
以“Arrhythmia”为检索词进行检索，收集心律失常相关靶点，其中GeneCards数据库2 205个（Relevance Score≥2），对疾病靶点与药物靶点取交集，得到二者交集靶点174个。见图1。
2.3 活性成分-作用靶点网络图分析
使用Cytoscape对174个交集靶点进行“活性成分-作用靶点”网络图的绘制。Network Analyzer计算分析得到209个节点，704条边，平均度值为6.7，根据度值筛选前20名的活性成分。其中度值排名前5的化合物分别为小檗浸碱（Berlambine）、表小檗碱（Epiberberine）、黄藤素（Palmatine）、黄柏酮（Obacunone）、小檗碱（Berberine），由此推测上述化合物可能是交泰丸治疗心律失常的重要活性成分。见图2，表2。
2.4 核心蛋白PPI网络图分析
將174个交集基因，导入STRING数据库，获取PPI网络图及对应的网络数据，使用Cytoscape对数据进行网络拓扑分析，得到173个节点，2 199条边，平均度值25.4。根据筛选度值前15的蛋白质，其中度值排名较高的ALB、AKT、MAPK3、VEGFA、SRC等核心靶点，在PPI网络中与其他蛋白相互作用较强。见图3，表3。
2.5 GO富集与KEGG富集分析
利用DAVID数据库对174个交集基因进行基因富集分析共得到生物过程（Biological Process，BP）621个、分子功能（Molecular Function，MF）121个，细胞成分（Cellular Component，CC）79个。根据校正后P值进行排序，选择GO富集和KEGG富集排名前15的条目绘制气泡图。BP主要与药物反应、蛋白磷酸化、细胞增殖的负调控、凋亡过程的负调控、细胞外调节蛋白激酶的负调控等过程相关;MF主要涉及凋亡过程、蛋白质结合、腺苷三磷酸、酶结合、相同蛋白质结合等功能;CC主要涉及细胞质膜、细胞膜、细胞外隙、细胞表面、内质网膜等。此外，KEGG富集分析筛选得到109条（P<0.05）信号通路，推测交泰丸治疗心律失常关键靶标所参与的通路主要涉及PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路、甲状腺激素信号通路、HIF-1信号通路等，推测交泰丸可能通过以上主要通路发挥治疗心律失常的作用。见图4。
2.6 分子对接
利用Autodock软件将活性成分-作用靶点网络图中得到的节点度值最高的5个活性成分：小檗浸碱、表小檗碱、黄藤素、黄柏酮、小檗碱，分别与PPI网络图中排名前5位的核心蛋白ALB、AKT1、MAPK3、VEGFA、SRC进行分子对接。配体和受体二者结合越稳定，二者结合能越低，由分子对接结果可知，各活性成分与目标受体蛋白对接的结合能均小于-6 kcal/mol，说明活性成分能够与配体自发结合并借助氢键等分子间作用力形成较为稳定的构象。其中表小檗碱与AKT1（-10.1 kcal/mol）结合性最好，从图中可看出表小檗碱与AKT1相互作用，结合后呈现稳定状态。结合情况见图5，分子对接构象见图6。
3 讨论
从中医学角度分析，心律失常多归属于“心悸”“怔忡”等范畴。中医认为心悸病机以脏腑功能失常为本，心神失养为标。早在先秦时期，《黄帝内经》一书就从心肾二脏论述该病，如“心病，治不得，索之水，水者肾也”，说明了病位在心而不止于心;《素问·大奇论》“肾肝并小弦欲惊”，指出惊悸的发生与肾亦有关系[10]。交泰丸是治疗心肾不交证的代表方，对心肾不交型心悸疗效显著。现代研究发现交泰丸及各组分含药血清对钠离子、钙离子电流均有不同程度的抑制，可通过改变膜反应性，消除折返激动，延长细胞动作电位从而发挥抗心律失常的作用[11-12]。
从有效药物成分分析，本研究通过网络药理得出交泰丸治疗心律失常的有效成分主要有小檗浸碱、表小檗碱、黄藤素、黄柏酮、小檗碱等。现有研究表明，表小檗碱是一种多靶标小分子，可通过AKT和ERK途径发挥其活性作用从而抑制胆固醇合成产生的抗血脂异常[13]，明显降低心血管疾病的危险因素，保护心肌免受缺血再灌注损伤[14]。黄藤素具有较强的抗心律失常、提高免疫功能、抗炎及抗菌等药理特性[15-16]，对氯仿-肾上腺素、哇巴因诱发的心律失常及大鼠复灌性和心肌缺血性心律失常等多种实验性大鼠模型心律失常均具有抑制作用[17]。黄柏酮属于柠檬苦素类似物，具有抗氧化性、抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用，通过调节血管内皮细胞NO的合成，减少超氧化物产生，从而降低由氧化损伤引起的对血管系统结构和功能造成的有害影响，同时下调AKT磷酸化水平来抑制血管平滑肌细胞的增殖，减少内膜增生，有助于治疗由于内皮功能障碍所引起的心血管疾病[18-19]。小檗碱主要通过阻断抑制激活钾离子通道，延长心肌细胞动作电位时程而发挥抗心律失常作用，能有效防治多种因素引起的室性心律失常[20]。在大鼠心脏缺血再灌注诱导的心律失常模型中，口服小檗碱可降低心肌组织ANP、BNP和cTn-I的水平，并可显著改善心肌结构性的损伤[21]，通过上调缺血心肌的蛋白激酶水平来实现保护心肌的作用[22]。
从关键核心靶点分析，在PPI网络中得到前5位靶点分别为ALB、AKT1、MAPK3、VEGFA、SRC。大量数据表明ALB的治疗机制不仅通过对血浆容量扩充的影响而介导，而且还通过对炎症和氧化应激的调节发挥作用[23]。低ALB水平可以预测稳定的冠状动脉疾病患者的主要不良心血管事件[24]。AKT具有调节细胞分化、凋亡、代谢等功能，并可影响各种促血管生成因子和抗血管生成因子的表达和活性，并指出AKT1作为AKT亚型之一，是血管生成相关异常的治疗靶标[25]。VEGF对内皮细胞具有促有丝分裂、细胞迁移和抗凋亡作用，增加血管的通透性，参与调节正常和病理性血管生成过程[26]，同时VEGF被认为是心律失常和冠状动脉疾病的病理生理因素，是潜在治疗靶标之一，对预后具有重要意义[27]。VEGFA作为VEGF家族中的重要一员，研究证实其在心律失常致死的大鼠心肌组织中呈弥漫性表达，可为致死性心律失常和冠状动脉供血不足引起的急性心肌缺血的鉴别诊断提供依据[28]。SRC是一种酪氨酸蛋白激酶，可调节细胞的代谢、成活和增殖，并在巨噬细胞介导下的炎症反应中起到关键作用[29]。C-SRC作为SRC的一种表现形式，其抑制可以改善心肌梗死后心律失常的缝隙连接蛋白43（Cx43）水平和传导速度，并降低心律失常的可诱导性[30]。 从信号通路分析，KEGG富集分析显示，交泰丸治疗心律失常主要涉及PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路、甲状腺激素信号通路、HIF-1信号通路等。PI3K-AKT途径主要通过磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）激活下游信号转导因子AKT来调节细胞的生长、增殖和成活，从而对心肌细胞起到保护作用，若PIP3信号转导的活性降低可导致心律失常[31]。研究证实白藜芦醇可通过PI3K-AKT信号通路增加心肌Cx43的水平和活性，从而防止再灌注性心律失常的发生[32]。Rap1作为心脏线粒体活性氧（ROS）生成的负调控因子，Epac2-Rap1信号会减弱线粒体ROS的产生并降低心律失常的易感性，若Epac2-Rap1信号通路受损会由于ROS依赖晚钠电流的激活而导致心律失常[33]。甲状腺激素（Thyroid hormones，TH）在心血管系统，特别是在心脏中具有中枢调节作用，血浆或组织中TH水平的变化与心血管功能的显著改变有关[34]。单纯TH可引起持续性窦性心动过速和交界性心动过速[35]，其甲状腺激素信号在包括心脏在内的所有器官或组织的分化、生长、代谢和生理功能中均起着至关重要的作用[36]。心肌受损和应激可促进心脏组织的重塑，这与心肌细胞死亡和纤维化发展相关，cAMP信号转导是受损心肌纤维化反应中的主要调节剂，调节涉及心肌纤维化的多种基本细胞过程，其中就包括调控成肌纤维细胞分化、增殖，胶原蛋白分泌和侵袭，避免其过度活化而导致心律失常、心功能障碍等疾病的发生[37]。缺氧诱导因子1（HIF-1）是一种转录因子，具有调节血管生成、血管重塑、葡萄糖代谢、细胞凋亡等功能，并参与多条细胞信号通路。当心脏因缺血而引起心肌超微结构、心功能和电生理一系列损伤性变化时，激活HIF-1可以上调与血管系统相关蛋白的基因表达，增加血流，降低缺血损伤，通过参与重建细胞代谢途径来实现对心脏组织的保护[38]。
最后，通过分子对接技术，计算得出交泰丸主要活性成分与核心蛋白的结合能均小于-6 kcal/mol，且对接较为稳定的组合为表小檗碱与AKT1（-10.1 kcal/mol）、小檗浸碱与SRC（-10.0 kcal/mol）2组。该结果表明交泰丸的活性成分与受体蛋白稳定结合，从而能够发挥治疗心律失常的作用，在分子层面为接下来的基础研究起到了奠基作用。
综上所述，本研究运用网络药理学方法和分子对接技术初步阐释了交泰丸通过多种靶点、多种生物过程和通路治疗心律失常的作用机制可能与调控细胞代谢、降低氧化刺激、改善血管重塑等方面有关，然而本研究的数据主要从数据库收录获取，具有一定局限性，故仍有部分結果需进一步完善和深入的实验研究。
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（2021-01-14收稿 责任编辑：魏庆双，徐颖）
关键词 交泰丸;心律失常;网络药理学;分子对接;中药药理;作用机制
Abstract Objective：To analyze the action mechanism of Jiaotai Pills in the treatment of arrhythmia by network pharmacology and molecular docking.Methods：The active components and their target genes of Rhizoma Coptidisn（黄连） and Cortex Cinnamomi（肉桂） were obtained through TCMSP platform and BATMAN database，GeneCards database retrieval were used to get the target genes associated with arrhythmia.Cytoscape software was used to draw “active ingredient-action target ” network graph.The STRING database was used to construct protein-protein interaction（PPI） network diagram of Jiaotai Pills in the treatment of arrhythmia.PPI network diagram was imported into Cytoscape.The DAVID database was used to perform GO（Gene Ontology） function and KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes） pathway enrichment analysis on drug-disease intersection targets，and Autodock Vina and Pymol were used for molecular docking.Results：A total of 31 active components and 556 component targets of Jiaotai Pills were collected.There were 2 205 targets related to arrhythmia; 174 drug and disease intersection targets were obtained; The Cytoscape topological analysis was used to obtain 20 core components such as berlambin，epiberberine，palmatine，obacunone，berberine and etc.and PPI network was used to obtain 15 core targets such as ALB，AKT1，MAPK3，VEGFA，SRC.A total of 821 GO terms and 109 KEGG pathways were obtained through bioinformatics enrichment analysis，mainly involving PI3K-AKT signaling pathway，Rap1 signaling pathway，cAMP signaling pathway，thyroid hormone signaling pathway，HIF-1 signaling pathway，etc.The results of molecular docking showed that the main active components had strong affinity with the core target（ALB，AKT1，MAPK3，VEGFA，SRC）.Conclusion：This study revealed the mechanism of Jiaotai Pills in the treatment of arrhythmia by regulating cellular metabolism，reducing oxidative stress，improving vascular remodeling，providing some pharmacological basis for the follow-up study on the treatment of arrhythmia by Jiaotai Pills. Keywords Jiaotai Pills; Arrhythmia; Network pharmacology; Molecular docking; Pharmacology of Chinese medicine; Mechanism of action
中图分类号：R285.6，R541.7文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.13.006
心律失常是指心脏节律的紊乱，主要有不规则心率、异常快速心率（心动过速）和异常慢速心率（心动过缓）3种表现[1]，临床上本病既可单独发病，又可同时伴发其他心血管疾病，具有发病率高及病情复杂等特点[2]，甚至危及生命。据中国心源性猝死流行病学调查显示，我国每年因心源性猝死患者可达54.4万例，其中80%以上是由恶性心律失常引起的[3]。目前在治疗方面，临床上多采用西药治疗，作用机制虽明确，但有“再致心律失常”的风险。在临床实践中，中药可通过多途径、多靶点等方向治疗疾病，疗效较为显著。
交泰丸是临床中治疗心悸的常用经典方剂，此方源自明·韩懋《韩氏医通》，主要用于治疗“心肾不交，怔忡不寐”，方由黄连、肉桂两味药物组成，黄连苦寒入心经，擅降心火不使其炎上，肉桂辛热入肾经，擅暖水脏不使其润下，二者寒温并用，水火既济，亦有泻南补北、交通心肾之妙[4]。因其组方独特，疗效显著，被后世临床治疗心悸广泛配合应用[5]。有研究报道使用交泰丸加味治疗室性早搏68例，早搏症状消失共计50例，症状明显好转有14例，总有效率达94%[6]。许凤云等[7]观察交泰丸对心血管系统的影响，结果显示交泰丸在增加耐缺氧能力、降压、增加冠脉流量及改善急性心肌缺血所引起的心电图的变化等方面效果较佳。
网络药理学是基于系统生物学的理论，融合多向药理学、生物信息学、计算机科学等多学科内容和技术，通过多种数据库进行网络分析，建立可視化网络关系图，从分子层面和整体角度对药物活性成分、作用靶点以及疾病的靶点蛋白进行分析，预测其作用机制[8-9]。目前临床对于交泰丸治疗心律失常的作用机制研究较少，本研究拟通过网络药理学技术，构建交泰丸成分-靶点-疾病网络进行分析，以探究其物质基础及治疗心律失常的作用机制，为后续研究提供有效的药理学依据。
1 资料与方法
1.1 交泰丸靶点收集
通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）与BATMAN数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），分别检索黄连、肉桂的活性成分。TCMSP平台筛选条件为口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18，BATMAN数据库设定为Score≥20进行筛选。通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取活性成分化学结构，保存Smile号，随后将Smile号上传至Swiss Target Prediction数据库，以“人类”为研究物种，进行相关活性成分的靶点预测，最后得到交泰丸活性成分及其作用的靶点。
1.2 心律失常靶点收集
通过GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）筛选治疗心律失常的相关靶点，以“arrhythmia”为关键词进行检索，筛选收集心律失常相关基因靶点。
1.3 活性成分-作用靶点网络图的绘制
选取活性成分作用靶点和疾病靶点的交集靶点，利用Cytoscape软件绘制活性成分-作用靶点网络图，使用Network Analyzer分析功能对网络图进行计算，根据结果筛选出核心活性成分。
1.4 核心蛋白的收集
通过STRING平台（https：//string-db.org）对交集靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）网络的绘制，将PPI信息导入Cytoscape中，对蛋白网络进行模块化聚类处理，通过Network Analyzer计算得出核心蛋白。
1.5 GO和KEGG富集分析
利用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov）对交集靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，设定阈值P≤0.5，选择生物过程（Biological Process，BP）、细胞成分（Cell Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3个模块进行GO富集分析，通路分析选择KEGG，并将得到的数据进行可视化，构建其排名前15个条目的气泡图。
1.6 分子对接
将“活性成分-作用靶点”网络图中节点度值最高的5个活性成分与PPI网络中节点度值最高的5个核心蛋白进行分子对接，验证其相互作用强度，活性成分结构通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取，蛋白质结构通过PDB数据库（http：//www.rcsb.org）获取。随后使用AutoDock Vina软件进行分子对接，借助Pymol软件对对接结果进行优化制图。
2 结果
2.1 交泰丸活性成分及其靶点获取
通过TCMSP平台以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，BATMAN数据库设定为Score≥20进行筛选，收集到活性成分31个，其中黄连14个、肉桂17个。见表1。通过Swiss Target Prediction数据库对活性成分进行靶点预测，共得到556靶点基因。 2.2 心律失常靶点获取
以“Arrhythmia”为检索词进行检索，收集心律失常相关靶点，其中GeneCards数据库2 205个（Relevance Score≥2），对疾病靶点与药物靶点取交集，得到二者交集靶点174个。见图1。
2.3 活性成分-作用靶点网络图分析
使用Cytoscape对174个交集靶点进行“活性成分-作用靶点”网络图的绘制。Network Analyzer计算分析得到209个节点，704条边，平均度值为6.7，根据度值筛选前20名的活性成分。其中度值排名前5的化合物分别为小檗浸碱（Berlambine）、表小檗碱（Epiberberine）、黄藤素（Palmatine）、黄柏酮（Obacunone）、小檗碱（Berberine），由此推测上述化合物可能是交泰丸治疗心律失常的重要活性成分。见图2，表2。
2.4 核心蛋白PPI网络图分析
將174个交集基因，导入STRING数据库，获取PPI网络图及对应的网络数据，使用Cytoscape对数据进行网络拓扑分析，得到173个节点，2 199条边，平均度值25.4。根据筛选度值前15的蛋白质，其中度值排名较高的ALB、AKT、MAPK3、VEGFA、SRC等核心靶点，在PPI网络中与其他蛋白相互作用较强。见图3，表3。
2.5 GO富集与KEGG富集分析
利用DAVID数据库对174个交集基因进行基因富集分析共得到生物过程（Biological Process，BP）621个、分子功能（Molecular Function，MF）121个，细胞成分（Cellular Component，CC）79个。根据校正后P值进行排序，选择GO富集和KEGG富集排名前15的条目绘制气泡图。BP主要与药物反应、蛋白磷酸化、细胞增殖的负调控、凋亡过程的负调控、细胞外调节蛋白激酶的负调控等过程相关;MF主要涉及凋亡过程、蛋白质结合、腺苷三磷酸、酶结合、相同蛋白质结合等功能;CC主要涉及细胞质膜、细胞膜、细胞外隙、细胞表面、内质网膜等。此外，KEGG富集分析筛选得到109条（P<0.05）信号通路，推测交泰丸治疗心律失常关键靶标所参与的通路主要涉及PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路、甲状腺激素信号通路、HIF-1信号通路等，推测交泰丸可能通过以上主要通路发挥治疗心律失常的作用。见图4。
2.6 分子对接
利用Autodock软件将活性成分-作用靶点网络图中得到的节点度值最高的5个活性成分：小檗浸碱、表小檗碱、黄藤素、黄柏酮、小檗碱，分别与PPI网络图中排名前5位的核心蛋白ALB、AKT1、MAPK3、VEGFA、SRC进行分子对接。配体和受体二者结合越稳定，二者结合能越低，由分子对接结果可知，各活性成分与目标受体蛋白对接的结合能均小于-6 kcal/mol，说明活性成分能够与配体自发结合并借助氢键等分子间作用力形成较为稳定的构象。其中表小檗碱与AKT1（-10.1 kcal/mol）结合性最好，从图中可看出表小檗碱与AKT1相互作用，结合后呈现稳定状态。结合情况见图5，分子对接构象见图6。
3 讨论
从中医学角度分析，心律失常多归属于“心悸”“怔忡”等范畴。中医认为心悸病机以脏腑功能失常为本，心神失养为标。早在先秦时期，《黄帝内经》一书就从心肾二脏论述该病，如“心病，治不得，索之水，水者肾也”，说明了病位在心而不止于心;《素问·大奇论》“肾肝并小弦欲惊”，指出惊悸的发生与肾亦有关系[10]。交泰丸是治疗心肾不交证的代表方，对心肾不交型心悸疗效显著。现代研究发现交泰丸及各组分含药血清对钠离子、钙离子电流均有不同程度的抑制，可通过改变膜反应性，消除折返激动，延长细胞动作电位从而发挥抗心律失常的作用[11-12]。
从有效药物成分分析，本研究通过网络药理得出交泰丸治疗心律失常的有效成分主要有小檗浸碱、表小檗碱、黄藤素、黄柏酮、小檗碱等。现有研究表明，表小檗碱是一种多靶标小分子，可通过AKT和ERK途径发挥其活性作用从而抑制胆固醇合成产生的抗血脂异常[13]，明显降低心血管疾病的危险因素，保护心肌免受缺血再灌注损伤[14]。黄藤素具有较强的抗心律失常、提高免疫功能、抗炎及抗菌等药理特性[15-16]，对氯仿-肾上腺素、哇巴因诱发的心律失常及大鼠复灌性和心肌缺血性心律失常等多种实验性大鼠模型心律失常均具有抑制作用[17]。黄柏酮属于柠檬苦素类似物，具有抗氧化性、抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用，通过调节血管内皮细胞NO的合成，减少超氧化物产生，从而降低由氧化损伤引起的对血管系统结构和功能造成的有害影响，同时下调AKT磷酸化水平来抑制血管平滑肌细胞的增殖，减少内膜增生，有助于治疗由于内皮功能障碍所引起的心血管疾病[18-19]。小檗碱主要通过阻断抑制激活钾离子通道，延长心肌细胞动作电位时程而发挥抗心律失常作用，能有效防治多种因素引起的室性心律失常[20]。在大鼠心脏缺血再灌注诱导的心律失常模型中，口服小檗碱可降低心肌组织ANP、BNP和cTn-I的水平，并可显著改善心肌结构性的损伤[21]，通过上调缺血心肌的蛋白激酶水平来实现保护心肌的作用[22]。
从关键核心靶点分析，在PPI网络中得到前5位靶点分别为ALB、AKT1、MAPK3、VEGFA、SRC。大量数据表明ALB的治疗机制不仅通过对血浆容量扩充的影响而介导，而且还通过对炎症和氧化应激的调节发挥作用[23]。低ALB水平可以预测稳定的冠状动脉疾病患者的主要不良心血管事件[24]。AKT具有调节细胞分化、凋亡、代谢等功能，并可影响各种促血管生成因子和抗血管生成因子的表达和活性，并指出AKT1作为AKT亚型之一，是血管生成相关异常的治疗靶标[25]。VEGF对内皮细胞具有促有丝分裂、细胞迁移和抗凋亡作用，增加血管的通透性，参与调节正常和病理性血管生成过程[26]，同时VEGF被认为是心律失常和冠状动脉疾病的病理生理因素，是潜在治疗靶标之一，对预后具有重要意义[27]。VEGFA作为VEGF家族中的重要一员，研究证实其在心律失常致死的大鼠心肌组织中呈弥漫性表达，可为致死性心律失常和冠状动脉供血不足引起的急性心肌缺血的鉴别诊断提供依据[28]。SRC是一种酪氨酸蛋白激酶，可调节细胞的代谢、成活和增殖，并在巨噬细胞介导下的炎症反应中起到关键作用[29]。C-SRC作为SRC的一种表现形式，其抑制可以改善心肌梗死后心律失常的缝隙连接蛋白43（Cx43）水平和传导速度，并降低心律失常的可诱导性[30]。 从信号通路分析，KEGG富集分析显示，交泰丸治疗心律失常主要涉及PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路、甲状腺激素信号通路、HIF-1信号通路等。PI3K-AKT途径主要通过磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）激活下游信号转导因子AKT来调节细胞的生长、增殖和成活，从而对心肌细胞起到保护作用，若PIP3信号转导的活性降低可导致心律失常[31]。研究证实白藜芦醇可通过PI3K-AKT信号通路增加心肌Cx43的水平和活性，从而防止再灌注性心律失常的发生[32]。Rap1作为心脏线粒体活性氧（ROS）生成的负调控因子，Epac2-Rap1信号会减弱线粒体ROS的产生并降低心律失常的易感性，若Epac2-Rap1信号通路受损会由于ROS依赖晚钠电流的激活而导致心律失常[33]。甲状腺激素（Thyroid hormones，TH）在心血管系统，特别是在心脏中具有中枢调节作用，血浆或组织中TH水平的变化与心血管功能的显著改变有关[34]。单纯TH可引起持续性窦性心动过速和交界性心动过速[35]，其甲状腺激素信号在包括心脏在内的所有器官或组织的分化、生长、代谢和生理功能中均起着至关重要的作用[36]。心肌受损和应激可促进心脏组织的重塑，这与心肌细胞死亡和纤维化发展相关，cAMP信号转导是受损心肌纤维化反应中的主要调节剂，调节涉及心肌纤维化的多种基本细胞过程，其中就包括调控成肌纤维细胞分化、增殖，胶原蛋白分泌和侵袭，避免其过度活化而导致心律失常、心功能障碍等疾病的发生[37]。缺氧诱导因子1（HIF-1）是一种转录因子，具有调节血管生成、血管重塑、葡萄糖代谢、细胞凋亡等功能，并参与多条细胞信号通路。当心脏因缺血而引起心肌超微结构、心功能和电生理一系列损伤性变化时，激活HIF-1可以上调与血管系统相关蛋白的基因表达，增加血流，降低缺血损伤，通过参与重建细胞代谢途径来实现对心脏组织的保护[38]。
最后，通过分子对接技术，计算得出交泰丸主要活性成分与核心蛋白的结合能均小于-6 kcal/mol，且对接较为稳定的组合为表小檗碱与AKT1（-10.1 kcal/mol）、小檗浸碱与SRC（-10.0 kcal/mol）2组。该结果表明交泰丸的活性成分与受体蛋白稳定结合，从而能够发挥治疗心律失常的作用，在分子层面为接下来的基础研究起到了奠基作用。
综上所述，本研究运用网络药理学方法和分子对接技术初步阐释了交泰丸通过多种靶点、多种生物过程和通路治疗心律失常的作用机制可能与调控细胞代谢、降低氧化刺激、改善血管重塑等方面有关，然而本研究的数据主要从数据库收录获取，具有一定局限性，故仍有部分結果需进一步完善和深入的实验研究。
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（2021-01-14收稿 责任编辑：魏庆双，徐颖）