【摘 要】
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目的 探究丹紫康膝冲剂延缓膝骨关节炎(KOA)模型大鼠软骨退变及软骨下骨异常骨重建的可能作用机制.方法 将40只SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、双氯芬酸钠组、丹紫康膝冲剂组,每组10只.空白组不做任何处理,其余3组采用Hulth法建立KOA模型.建模成功后,双氯芬酸钠组予5 mg/kg双氯芬酸钠灌胃,丹紫康膝冲剂组予1.67 g/kg丹紫康膝冲剂灌胃,空白组、模型组均予等容积0.9％氯化钠注射液灌胃,每日灌胃1次,连续28 d.采用苏木精-伊红(HE)染色和番红-O-固绿组织染色制作病理切片观察软骨病
【机 构】
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湖南中医药大学第二附属医院护理部,湖南 长沙 410005
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目的 探究丹紫康膝冲剂延缓膝骨关节炎(KOA)模型大鼠软骨退变及软骨下骨异常骨重建的可能作用机制.方法 将40只SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、双氯芬酸钠组、丹紫康膝冲剂组,每组10只.空白组不做任何处理,其余3组采用Hulth法建立KOA模型.建模成功后,双氯芬酸钠组予5 mg/kg双氯芬酸钠灌胃,丹紫康膝冲剂组予1.67 g/kg丹紫康膝冲剂灌胃,空白组、模型组均予等容积0.9％氯化钠注射液灌胃,每日灌胃1次,连续28 d.采用苏木精-伊红(HE)染色和番红-O-固绿组织染色制作病理切片观察软骨病理损伤情况,并记录病理学退变指标;末端转移酶介导的DIG-dUPT切口末端标记法(TUNEL)观察软骨细胞凋亡情况;酶联免疫吸附法检测外周血白细胞介素1β(IL-1β)、IL-18、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、Ⅱ型胶原C端肽(CTXⅡ)、Ⅱ型胶原C前肽(CPⅡ)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶3(MMP-3)、MMP-13、骨形态发生蛋白7(BMP-7)蛋白表达;取大鼠右侧胫骨近端关节离体标本进行Micro-CT扫描,测量软骨下骨微结构参数骨体积(BV);骨体积分数:骨体积/总体积(BV/TV)、骨小梁平均厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、体积骨密度(vBMD).结果 经HE染色,空白组大鼠软骨滑膜组织完整,细胞排列整齐,无炎症细胞浸润和基质损伤或蜕变.模型组大鼠软骨组织表面凸凹不平,软骨表层变薄,细胞排列不规则,此外可见大量炎症细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润,而且深部软骨细胞可见明显细胞核压缩,膝关节宽度和关节退变深度显著增加.与模型组比较,丹紫康膝冲剂组大鼠软骨细胞排列均匀,胞核和胞质逐渐恢复正常.经番红-O-固绿染色,空白组大鼠软骨组织染色均匀,结构清晰.模型组大鼠骨关节面不平,软骨钙化,胶原纤维增生,软骨细胞外基质经番红O染色变浅,染色不均一,而且软骨陷窝结构扩张.与模型组比较,丹紫康膝冲剂组大鼠软骨组织番红O稍淡染,潮线逐渐清晰,细胞排列逐渐均匀.与空白组比较,模型组大鼠关节软骨基质丢失宽度、改良的国际骨关节炎研究会(OARSI)评分、软骨退变总宽度、软骨退变最显著处的宽度均增加(P<0.05);与模型组比较,双氯芬酸钠组、丹紫康膝冲剂组大鼠上述指标则减少(P0.05).与空白组比较,模型组大鼠软骨细胞凋亡指数升高(P<0.05);与模型组比较,双氯芬酸钠组、丹紫康膝冲剂组大鼠软骨细胞凋亡指数降低(P<0.05);与双氯芬酸钠组比较,丹紫康膝冲剂组软骨细胞凋亡指数降低(P<0.05).与空白组比较,模型组大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ水平均升高,CPⅡ水平降低(P<0.05);与模型组比较,双氯芬酸钠组、丹紫康膝冲剂组大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CTXⅡ水平均降低(P<0.05),CPⅡ水平升高(P<0.05);与双氯芬酸钠组比较,丹紫康膝冲剂组大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、CPⅡ水平均升高(P<0.05),CTXⅡ水平降低(P<0.05).经Western blot检测,与空白组比较,模型组大鼠软骨组织Bax、MMP-3、MMP-13蛋白表达量升高(P<0.05),Bcl-2、BMP-7蛋白表达量降低(P<0.05);与模型组比较,双氯芬酸钠组、丹紫康膝冲剂组大鼠软骨组织Bax、MMP-3、MMP-13蛋白表达量均降低(P<0.05),Bcl-2、BMP-7蛋白表达量均升高(P<0.05);与双氯芬酸钠组比较,丹紫康膝冲剂组大鼠软骨组织Bcl-2、Bax、MMP-3蛋白表达量降低(P<0.05),BMP-7蛋白表达量升高(P<0.05).经Micro-CT扫描,与空白组比较,模型组大鼠胫骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均降低(P<0.05);与模型组比较,双氯芬酸钠组、丹紫康膝冲剂组大鼠胫骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均升高(P<0.05);与双氯芬酸钠组比较,丹紫康膝冲剂组大鼠胫骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N、vBMD均升高(P<0.05).模型组大鼠胫骨近端软骨表层可见大量基质迫损或丢失,软骨下骨骨小梁数量减少、排列紊乱并出现断裂现象.与模型组比较,丹紫康膝冲剂组大鼠软骨表层基质虽然也存在破损,但是最深至浅层或中层,尚未累及软骨下骨;软骨下骨骨小梁排列整齐,关节边缘未见骨赘形成.结论 丹紫康膝冲剂可有效降低KOA模型大鼠炎症细胞因子分泌和MMPs表达,减轻软骨组织病理性损伤,改善KOA早期软骨下骨生物力学性能和微结构改变,从而延缓KOA大鼠模型软骨组织进行性退变和软骨下骨异常骨重塑的发生.
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