论文部分内容阅读
摘 要 目的：探讨Ki67核抗原
关键词 甲状腺乳头状癌 Ki67核抗原 甲状腺转录因子-1 人表皮生长因子受体-2 人骨髓上皮细胞-1
中图分类号：R736.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2014）10-0024-04
ABSTRACT Objective： To investigate the clinical value of differentiation of the papillary thyroid carcinoma （PTC） from the benign thyroid nodules with Ki67 nuclear antigen （Ki67）， thyroid transcription factor-l （TTF-1）， human epidermal growth factor receptor type-2 （HER-2/neu）， and human bone marrow endothelial cell-1（HBME-1）. Methods： The parafin sections of 180 cases with PTC and 190 cases with the benign thyroid nodules were retrospectively analyzed. The levels of Ki67， TTF-1， HBME-1 and HER-2/neu were determined immunohistochemically. Results： The positive rates of the expressions of 4 markers were higher in PTC specimens than in the benign thyroid nodules specimens （P=0.000）. When using a single marker， the detection of HER-2/neu had the most sensitivity （79.4%） and that of HBME-1 the most specificity （96.8%）. The detection combined with Ki67， HER-2/neu and HBME-1 had the most sensitivity （89.8%）. The detection combined with HER-2/neu+ TTF-1 and HER-2/neu+TTF-1+HBME-1 had the same specificity （99.4%， P<0.01）. Conclusions： When combining Ki67 and TTF-1 with HER-2/neu or HBME-1， the sensitivity and specificity in the single indicator determination can be increased obviously in the diagnosis of PTC.
KEY WORDS papillary thyroid carcinoma； Ki67 nuclear antigen； thyroid transcription factor-l； human epidermal growth factor receptor type-2； human bone marrow endothelial cell-1
甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma， PTC）是最常见的甲状腺恶性肿瘤，其发病率在近年呈明显上升趋势。耶鲁大学医学院的研究表明，从2001年到2008年，美国PTC的发病率增加了60.8%[1]。PTC细胞组织学的病理诊断主要基于镜下观察，除了那些缺少典型镜下特征的病例，大部分PTC能容易确诊[2]。免疫组化标志物有助于鉴别PTC和甲状腺良性肿瘤。已有研究表明，对组织细胞学标本行不同细胞角蛋白的免疫组化染色，可作为PTC诊断的辅助技术[2]。但是，对以提高PTC诊断准确性为目的的多种标志物联合检测方法，目前尚存在争论。Nga等[3]研究认为，在PTC细胞学诊断中，联合应用人骨髓内皮细胞-1（human bone marrow endothelial cell-1， HBME-1）和细胞角蛋白19（cytokeratin-19， CK-19）的敏感性和特异性均为100.0%，但另有研究表明，联合应用两者的敏感性和特异性则分别低至62.0%和95.0%。
本研究采用免疫组化法，分析Ki67核抗原（Ki67 nuclear antigen， Ki67）、甲状腺转录因子-1（thyroid transcription factor-l，TTF-1）、人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor type-2， HER-2/neu）和HBME-1在PTC以及良性甲状腺结节标本中的表达水平，研究4种蛋白在PTC鉴别诊断中的意义。
材料与方法
方法
所有标本均经甲醛固定，常规乙醇脱水和石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行HE染色，均由2名病理医生双盲独立评估。临床资料完整，术前未经任何处理，按甲状腺癌诊断标准行病理分类。
免疫组化染色采用S-P法，4 μm厚连续切片，按试剂盒说明书操作。所选Ki67、TTF-1、HBME-1和HER-2/neu抗体均为鼠抗人单克隆抗体，所有抗体、S-P试剂盒及显色剂购自上海长岛生物技术公司。使用Olympus BX51T光学显微镜，在100和400倍下观察和拍照。Ki67以细胞核出现棕黄色颗粒判定为阳性，TTF-1染色定位于细胞核，HER-2/neu定位于细胞质或细胞膜。Ki67、 TTF-1、HBME-1和HER-2/neu阳性的PTC标本由华山医院病理科提供，用于免疫组化染色的阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。随机选取每张切片的10个高倍视野，行阳性细胞计数，采用半定量分析法计算细胞阳性率。计算Ki67标记指数，每张切片取10个高倍视野，观察阳性细胞并计数讨论 准确的甲状腺癌诊断对于积极的临床治疗至关重要。目前对于甲状腺疾病，尤其是PTC诊断的金标准是组织学检查。诊断PTC是依据显微镜下见到典型的核形态，具体表现是与正常滤泡上皮细胞或其他甲状腺疾病相比，PTC的细胞密集、彼此交叉重叠、呈卵圆型的较大细胞核，或呈毛玻璃状细胞核。细胞核中染色质较少，或缺少核仁。此外核沟的存在也是PTC细胞核形态的主要特征。通过镜下检查，大部分PTC诊断可以明确。对于一些组织学诊断有困难的病例，免疫组化分析和分子技术等具有重要的辅助意义。
免疫组化分析中的Ki67蛋白是人类增生细胞核中普遍存在的标志性抗原。核蛋白由相对分子质量345 000和395 000两条多肽链组成，其基因定位于10号染色体。Ki67与肿瘤分化程度、浸润指标、转移及预后密切相关[6]，是评估细胞增殖的指标。Ki67在G0期和G1早期不表达，在G1晚期出现，S、G2和M期持续存在。随着细胞周期的进展，抗原表达逐渐增加，至G2期和M期渐达高峰，反映了细胞增殖活性。Ki67与肿瘤细胞的合成代谢有关，其检测能较客观地反映肿瘤的性质，多用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度，也用于探讨细胞增殖活性、细胞周期、肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为，以及与预后的关系。目前的临床资料表明，Ki67增值指数高低与肿瘤的分化程度、浸润转移以及预后密切相关，所以是肿瘤诊断和预后中的重要标志物。杨玉清等[4]对63例PTC的研究发现，26例为Ki67阳性表达，37例为阴性表达，阳性表达率为41.0%，40例良性病变均为阴性，组间差异有统计学意义。本研究发现，Ki67在180例PTC中的阳性率为62.2%，在190例良性病变中，25.3%呈阳性或弱阳性表现，组间差异有统计学意义。
TTF-1也称为甲状腺特异增强子结合蛋白，是NKX基因家族中的同源转录因子之一，由NKX2.1基因所编码，位于人类14q13。TTF-1常在甲状腺滤泡细胞、滤泡旁C细胞中表达，是一种器官特异性的转录因子[5]，其在甲状腺、肺、间脑的器官形成及甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶等蛋白的形成过程中起重要作用。研究表明，TTF-1在滤泡细胞衍生的肿瘤，滤泡性腺瘤、PTC、滤泡癌中阳性表达率高达83%～100%[6]。未分化癌的阳性表达率较低，为0～25%，均呈灶性表达。在本研究4种蛋白标志物中，TTF-1对诊断PTC具有较高的特异性（94.3%），仅很少良性结节出现TTF-1弱阳性。TTF-1在PTC和良性结节中的阳性率分别为55.6%和3.2%，其对PTC诊断的敏感性低于其他3种标志物。
是细胞癌基因之一，其编码产物与表皮生长因子受体50%同源，主要参与细胞的分裂和生长，且属于酪氨酸激酶受体家族。HER-2/neu于胚胎发育期开始表达，成年后的正常组织中仅可检测到少量HER-2/neu基因。正常情况下，该基因处于非激活状态。HBME-1是间皮细胞表面微绒毛的一种抗原，为酸性氨基酸多聚糖蛋白，主要成份为透明质酸，已用于内皮细胞来源肿瘤的诊断。有学者认为HBME-1是PTC较好的标志。黄堃等[8]发现HBME-1表达阳性率在45例甲状腺恶性肿瘤中为88.9%，而在86例甲状腺良性病变中则为12.8%，差异有统计学意义。本研究发现，HBME-1在PTC中的阳性率为77.8%，但在甲状腺良性结节中的阳性率仅为5.3%，对于PTC诊断具有较高的特异性（94.7%）。
联合检测多种指标对于提高PTC诊断的准确性始终存在争议，文献报道HBME-1、CK19、galectin-3等指标联合检测诊断PTC具有敏感性和特异性高的意义，但对于Ki67、TTF-1与其他标志物联合检测的报道少见。本研究发现，在4种蛋白标志物中，联合检测Ki67和TTF-1以及HER-2/neu和HBME-1对诊断PTC的敏感性未见明显提高。然而，Ki67、TTF-1分别与HER-2/neu或HBME-1联合、，对诊断PTC的敏感性和特异性明显提高（P<0.01）。Ki67、HER-2/neu和HBME-1的3者联合检测具有最高的敏感性（89.8%），其次为Ki67、HER-2/neu、HBME-1和TTF-1的联合检测，敏感性为88.3%。HER-2/neu、HBME-1和TTF-1的联合检测以及HER-2/neu和TTF-1的联合检测具有最高的特异性（99.4%）。
综上所述，Ki67和TTF-1标志物在联合HER-2/neu或（和）HBME-1检测时，与检测4者中单项指标相比，可显著提高诊断敏感性和特异性，所以在检测Ki67和TTF-1时，若联合其他标志物共同检测可提高对PTC诊断的准确度，而仅HER-2/neu与HBME-1的联合检验，对于提高PTC诊断的准确率意义不大。
参考文献
Kazaure HS， Roman SA， Sosa JA. Aggressive variants of papillary thyroid cancer： incidence， characteristics and predictors of survival among 43，738 patients[J]. Ann Surg Oncol， 2012， 19（6）： 1874-1880.
Papale F， Cafiero G， Grimaldi A， et al. Galectin-3 expression in thyroid fine needle cytology （t-FNAC） uncertain cases： validation of molecular markers and technology innovation[J]. J Cell Physiol， 2013， 228（5）： 968-974.
Nga ME， Lim GS， Soh CH， et al. HBME-1 and CK19 are highly discriminatory in the cytological diagnosis of papillary thyroid carcinoma[J]. Diagn Cytopathol， 2008， 36（8）： 550-556.
杨玉清， 姚宏. CK19 Galectin-3 HBME-1 S-100及Ki67在甲状腺乳头状癌中表达的意义[J]. 中国药物与临床， 2012， 12（9）： 1144-1146.
Ordó?ez NG. Value of thyroid transcription factor-l immunostaining in tumor diagnosis：a review and update[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol， 2012， 20（5）： 429-444.
Tan A， Etit D， Bayol U， et a1. Comparison of proliferating cellnuclear antigen，thyroid transcription factor-l，Ki-67，o63，p53 and high-molecular weight cytokeratin expressions in papillary thyroid carcinoma，follicular carcinoma，and follicular adenoma[J]. Ann Diagn Pathol， 201l， 15（2）： 108-116.
Se?kin S， Karagece ?. Expression of CK-19， cErbB2， galectin-3， and p53 in papillary thyroid carcinomas[J]. Turk J Med Sci， 2010， 40（2）： 207-212.
黄堃， 龚卫东， 王南鹏， 等. galectin-3， HBME-1， CK19 及 RET 在甲状腺肿瘤中的表达情况及其临床价值[J]. 中国普外基础与临床杂志， 2013， 20（2）： 156-160.
（收稿日期：2014-03-25）
关键词 甲状腺乳头状癌 Ki67核抗原 甲状腺转录因子-1 人表皮生长因子受体-2 人骨髓上皮细胞-1
中图分类号：R736.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2014）10-0024-04
ABSTRACT Objective： To investigate the clinical value of differentiation of the papillary thyroid carcinoma （PTC） from the benign thyroid nodules with Ki67 nuclear antigen （Ki67）， thyroid transcription factor-l （TTF-1）， human epidermal growth factor receptor type-2 （HER-2/neu）， and human bone marrow endothelial cell-1（HBME-1）. Methods： The parafin sections of 180 cases with PTC and 190 cases with the benign thyroid nodules were retrospectively analyzed. The levels of Ki67， TTF-1， HBME-1 and HER-2/neu were determined immunohistochemically. Results： The positive rates of the expressions of 4 markers were higher in PTC specimens than in the benign thyroid nodules specimens （P=0.000）. When using a single marker， the detection of HER-2/neu had the most sensitivity （79.4%） and that of HBME-1 the most specificity （96.8%）. The detection combined with Ki67， HER-2/neu and HBME-1 had the most sensitivity （89.8%）. The detection combined with HER-2/neu+ TTF-1 and HER-2/neu+TTF-1+HBME-1 had the same specificity （99.4%， P<0.01）. Conclusions： When combining Ki67 and TTF-1 with HER-2/neu or HBME-1， the sensitivity and specificity in the single indicator determination can be increased obviously in the diagnosis of PTC.
KEY WORDS papillary thyroid carcinoma； Ki67 nuclear antigen； thyroid transcription factor-l； human epidermal growth factor receptor type-2； human bone marrow endothelial cell-1
甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma， PTC）是最常见的甲状腺恶性肿瘤，其发病率在近年呈明显上升趋势。耶鲁大学医学院的研究表明，从2001年到2008年，美国PTC的发病率增加了60.8%[1]。PTC细胞组织学的病理诊断主要基于镜下观察，除了那些缺少典型镜下特征的病例，大部分PTC能容易确诊[2]。免疫组化标志物有助于鉴别PTC和甲状腺良性肿瘤。已有研究表明，对组织细胞学标本行不同细胞角蛋白的免疫组化染色，可作为PTC诊断的辅助技术[2]。但是，对以提高PTC诊断准确性为目的的多种标志物联合检测方法，目前尚存在争论。Nga等[3]研究认为，在PTC细胞学诊断中，联合应用人骨髓内皮细胞-1（human bone marrow endothelial cell-1， HBME-1）和细胞角蛋白19（cytokeratin-19， CK-19）的敏感性和特异性均为100.0%，但另有研究表明，联合应用两者的敏感性和特异性则分别低至62.0%和95.0%。
本研究采用免疫组化法，分析Ki67核抗原（Ki67 nuclear antigen， Ki67）、甲状腺转录因子-1（thyroid transcription factor-l，TTF-1）、人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor type-2， HER-2/neu）和HBME-1在PTC以及良性甲状腺结节标本中的表达水平，研究4种蛋白在PTC鉴别诊断中的意义。
材料与方法
方法
所有标本均经甲醛固定，常规乙醇脱水和石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行HE染色，均由2名病理医生双盲独立评估。临床资料完整，术前未经任何处理，按甲状腺癌诊断标准行病理分类。
免疫组化染色采用S-P法，4 μm厚连续切片，按试剂盒说明书操作。所选Ki67、TTF-1、HBME-1和HER-2/neu抗体均为鼠抗人单克隆抗体，所有抗体、S-P试剂盒及显色剂购自上海长岛生物技术公司。使用Olympus BX51T光学显微镜，在100和400倍下观察和拍照。Ki67以细胞核出现棕黄色颗粒判定为阳性，TTF-1染色定位于细胞核，HER-2/neu定位于细胞质或细胞膜。Ki67、 TTF-1、HBME-1和HER-2/neu阳性的PTC标本由华山医院病理科提供，用于免疫组化染色的阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。随机选取每张切片的10个高倍视野，行阳性细胞计数，采用半定量分析法计算细胞阳性率。计算Ki67标记指数，每张切片取10个高倍视野，观察阳性细胞并计数讨论 准确的甲状腺癌诊断对于积极的临床治疗至关重要。目前对于甲状腺疾病，尤其是PTC诊断的金标准是组织学检查。诊断PTC是依据显微镜下见到典型的核形态，具体表现是与正常滤泡上皮细胞或其他甲状腺疾病相比，PTC的细胞密集、彼此交叉重叠、呈卵圆型的较大细胞核，或呈毛玻璃状细胞核。细胞核中染色质较少，或缺少核仁。此外核沟的存在也是PTC细胞核形态的主要特征。通过镜下检查，大部分PTC诊断可以明确。对于一些组织学诊断有困难的病例，免疫组化分析和分子技术等具有重要的辅助意义。
免疫组化分析中的Ki67蛋白是人类增生细胞核中普遍存在的标志性抗原。核蛋白由相对分子质量345 000和395 000两条多肽链组成，其基因定位于10号染色体。Ki67与肿瘤分化程度、浸润指标、转移及预后密切相关[6]，是评估细胞增殖的指标。Ki67在G0期和G1早期不表达，在G1晚期出现，S、G2和M期持续存在。随着细胞周期的进展，抗原表达逐渐增加，至G2期和M期渐达高峰，反映了细胞增殖活性。Ki67与肿瘤细胞的合成代谢有关，其检测能较客观地反映肿瘤的性质，多用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度，也用于探讨细胞增殖活性、细胞周期、肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为，以及与预后的关系。目前的临床资料表明，Ki67增值指数高低与肿瘤的分化程度、浸润转移以及预后密切相关，所以是肿瘤诊断和预后中的重要标志物。杨玉清等[4]对63例PTC的研究发现，26例为Ki67阳性表达，37例为阴性表达，阳性表达率为41.0%，40例良性病变均为阴性，组间差异有统计学意义。本研究发现，Ki67在180例PTC中的阳性率为62.2%，在190例良性病变中，25.3%呈阳性或弱阳性表现，组间差异有统计学意义。
TTF-1也称为甲状腺特异增强子结合蛋白，是NKX基因家族中的同源转录因子之一，由NKX2.1基因所编码，位于人类14q13。TTF-1常在甲状腺滤泡细胞、滤泡旁C细胞中表达，是一种器官特异性的转录因子[5]，其在甲状腺、肺、间脑的器官形成及甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶等蛋白的形成过程中起重要作用。研究表明，TTF-1在滤泡细胞衍生的肿瘤，滤泡性腺瘤、PTC、滤泡癌中阳性表达率高达83%～100%[6]。未分化癌的阳性表达率较低，为0～25%，均呈灶性表达。在本研究4种蛋白标志物中，TTF-1对诊断PTC具有较高的特异性（94.3%），仅很少良性结节出现TTF-1弱阳性。TTF-1在PTC和良性结节中的阳性率分别为55.6%和3.2%，其对PTC诊断的敏感性低于其他3种标志物。
是细胞癌基因之一，其编码产物与表皮生长因子受体50%同源，主要参与细胞的分裂和生长，且属于酪氨酸激酶受体家族。HER-2/neu于胚胎发育期开始表达，成年后的正常组织中仅可检测到少量HER-2/neu基因。正常情况下，该基因处于非激活状态。HBME-1是间皮细胞表面微绒毛的一种抗原，为酸性氨基酸多聚糖蛋白，主要成份为透明质酸，已用于内皮细胞来源肿瘤的诊断。有学者认为HBME-1是PTC较好的标志。黄堃等[8]发现HBME-1表达阳性率在45例甲状腺恶性肿瘤中为88.9%，而在86例甲状腺良性病变中则为12.8%，差异有统计学意义。本研究发现，HBME-1在PTC中的阳性率为77.8%，但在甲状腺良性结节中的阳性率仅为5.3%，对于PTC诊断具有较高的特异性（94.7%）。
联合检测多种指标对于提高PTC诊断的准确性始终存在争议，文献报道HBME-1、CK19、galectin-3等指标联合检测诊断PTC具有敏感性和特异性高的意义，但对于Ki67、TTF-1与其他标志物联合检测的报道少见。本研究发现，在4种蛋白标志物中，联合检测Ki67和TTF-1以及HER-2/neu和HBME-1对诊断PTC的敏感性未见明显提高。然而，Ki67、TTF-1分别与HER-2/neu或HBME-1联合、，对诊断PTC的敏感性和特异性明显提高（P<0.01）。Ki67、HER-2/neu和HBME-1的3者联合检测具有最高的敏感性（89.8%），其次为Ki67、HER-2/neu、HBME-1和TTF-1的联合检测，敏感性为88.3%。HER-2/neu、HBME-1和TTF-1的联合检测以及HER-2/neu和TTF-1的联合检测具有最高的特异性（99.4%）。
综上所述，Ki67和TTF-1标志物在联合HER-2/neu或（和）HBME-1检测时，与检测4者中单项指标相比，可显著提高诊断敏感性和特异性，所以在检测Ki67和TTF-1时，若联合其他标志物共同检测可提高对PTC诊断的准确度，而仅HER-2/neu与HBME-1的联合检验，对于提高PTC诊断的准确率意义不大。
参考文献
Kazaure HS， Roman SA， Sosa JA. Aggressive variants of papillary thyroid cancer： incidence， characteristics and predictors of survival among 43，738 patients[J]. Ann Surg Oncol， 2012， 19（6）： 1874-1880.
Papale F， Cafiero G， Grimaldi A， et al. Galectin-3 expression in thyroid fine needle cytology （t-FNAC） uncertain cases： validation of molecular markers and technology innovation[J]. J Cell Physiol， 2013， 228（5）： 968-974.
Nga ME， Lim GS， Soh CH， et al. HBME-1 and CK19 are highly discriminatory in the cytological diagnosis of papillary thyroid carcinoma[J]. Diagn Cytopathol， 2008， 36（8）： 550-556.
杨玉清， 姚宏. CK19 Galectin-3 HBME-1 S-100及Ki67在甲状腺乳头状癌中表达的意义[J]. 中国药物与临床， 2012， 12（9）： 1144-1146.
Ordó?ez NG. Value of thyroid transcription factor-l immunostaining in tumor diagnosis：a review and update[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol， 2012， 20（5）： 429-444.
Tan A， Etit D， Bayol U， et a1. Comparison of proliferating cellnuclear antigen，thyroid transcription factor-l，Ki-67，o63，p53 and high-molecular weight cytokeratin expressions in papillary thyroid carcinoma，follicular carcinoma，and follicular adenoma[J]. Ann Diagn Pathol， 201l， 15（2）： 108-116.
Se?kin S， Karagece ?. Expression of CK-19， cErbB2， galectin-3， and p53 in papillary thyroid carcinomas[J]. Turk J Med Sci， 2010， 40（2）： 207-212.
黄堃， 龚卫东， 王南鹏， 等. galectin-3， HBME-1， CK19 及 RET 在甲状腺肿瘤中的表达情况及其临床价值[J]. 中国普外基础与临床杂志， 2013， 20（2）： 156-160.
（收稿日期：2014-03-25）