【摘 要】
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目的 门静脉注射小鼠铁渊素(Hepcidin)基因特异性小发夹RNA(shRNA)重组腺病毒干扰载体,观察其对肝脏Hepcidin mRNA的干扰效果.方法 根据Genebank小鼠Hepcidin基因序列及相关文献,设计shRNA并合成1对互补的DNA单链寡核苷酸,退火后克隆至线性化pENTR/U6入门载体,以CMV-EGFP改造载体,利用Invitrogen公司LR重组系统与pAd/BLOCK
【机 构】
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浙江省嘉兴市第二医院麻醉科,314000,310003杭州,浙江大学医学院附属第一医院麻醉科,310003杭州,浙江大学医学院附属第一医院麻醉科
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目的 门静脉注射小鼠铁渊素(Hepcidin)基因特异性小发夹RNA(shRNA)重组腺病毒干扰载体,观察其对肝脏Hepcidin mRNA的干扰效果.方法 根据Genebank小鼠Hepcidin基因序列及相关文献,设计shRNA并合成1对互补的DNA单链寡核苷酸,退火后克隆至线性化pENTR/U6入门载体,以CMV-EGFP改造载体,利用Invitrogen公司LR重组系统与pAd/BLOCK-IT-DEST进行重组,构建pAD-U6-shRNA-CMV-EGFP腺病毒载体,转染293A细胞进行包装、扩增,获得腺病毒.实验组用BALB/C小鼠麻醉后行病毒门静脉注射,常规饲养10d后取成活小鼠肝组织,Trizol法提取RNA,半定量逆转录聚合酶链反应(Sq RT-PCR)法检测mRNA表达.另检测正常小鼠肝脏mRNA表达作对照.结果 经测序鉴定证实pAD-U6-shRNA-CMV-EGFP腺病毒载体构建成功,获得病毒的滴度为:2.7×109 ifu/ml.实验组Hepcidin基因相对表达量为1.30±0.53,明显低于对照组(6.39±1.00).结论 成功构建小鼠Hepcidin基因shRNA重组腺病毒干扰载体,其门静脉注射能够有效抑制目的基因表达。
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