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摘要 [目的]从华中五味子中获得高纯度五味子酚的制备方法。[方法]采用95%乙醇热回流对华中五味子中的化学成分进行提取，通过高效液相色谱检测不同产地华中五味子中五味子酚的含量，选择高含量产地的样品提取物通过正、反相硅胶柱层析法进行纯化，从中制备出高纯度的五味子酚。[结果]四川产华中五味子中的五味子酚相对含量较高，从中可制备较多量的高纯度五味子酚。[结论]用正、反相硅胶柱层析法能够简单快速地从华中五味子中获得高纯度五味子酚，丰富了获得五味子酚的资源和制备方法，为五味子酚化学和生物学的可持续研究提供了物质基础。
关键词 华中五味子；五味子酚；提取分离；制备方法
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）22-054-03
Abstract [Objective] To prepare the high purity schisanhenol from Schisandra sphenanthera. [Method] After the chemical constituents of Schisandra sphenanthera with 95% ethanol were extracted， the schisanhenol content in them was detected by HPLC. And schisanhenol with the high purity was prepared from the sample with the high content by positive and reverse phase silica gel column chromatography. [Result] The relative content of schisanhenol in Schisandra sphenanthera collected from Sichuan Province was the most highest. [Conclusion] By positive and reverse phase silica gel column chromatography， high purity schisanhenol could be quickly and easily obtained from Schisandra sphenanthera， which will enrich the resource and preparation method of schisanhenol， and provide the material base for sustainable research on chemistry and biology of schisanhenol.
Key words Schisandra sphenanthera； Schisanhenol； Extraction and separation； Preparation method
五味子酚是紅花五味子（Schisandra rubriflora Rehd. et Wils.）中含量较高的一种活性联苯环辛二烯类木脂素，具有显著的抗氧化活性并可保护氧自由基引起的心脏、肝脏线粒体损伤和神经细胞损伤[1-4]。近几年来的药理学研究表明五味子酚或其衍生物是十分具有开发价值的抗氧化剂[5-7]。但因为红花五味子资源分布有限，果实采集困难，很难获得大量的五味子酚进行进一步的科学研究。因此，扩大获得五味子酚的资源，研究其中获得五味子酚的制备方法对创新药物的可持续性研发具有十分重要的现实意义。
徐丹等首次在华中五味子中分离得到过五味子酚[8]，华中五味子为五味子科五味子属植物华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils. 的干燥成熟果实[9]，商品名为南五味子。南五味子味酸、甘，温，归肺、心、肾经，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等病症，其主要有效成分为联苯环辛二烯类木脂素，有降低血清转氨酶作用。目前华中五味子的果实已在临床上被应用于治疗急慢性肝炎[10-12]。华中五味子在我国主要分布于山西、陕西、甘肃、山东、江苏、安徽、浙江、江西、福建、河南、湖北、湖南、四川、贵州、云南东北部，资源很丰富。笔者在此利用HPLC方法对不同产地的华中五味子中五味子酚进行含量测定，选出含量最高产地的华中五味子，对其中的五味子酚进行提取和制备，丰富了获得五味子酚的资源和制备方法，为五味子酚化学和生物学的可持续研究提供物质基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
仪器。美国Agilent 1100型高校液相色谱仪，OSB-21000旋转蒸发器（上海爱朗仪器有限公司），NOVA 400 MHz超导核磁共振波谱仪（以TMS为内标，美国瓦里安公司），GC-MS 5973型气相色谱-质谱联用仪（美国惠普公司），ME203E型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），ZF-2型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂），98-Ⅰ-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司），DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.1.2
试剂。五味子酚对照品为实验室自制（纯度>99.0%）。反相C-18（Rp-18，粒度 40～63 μm）薄层色谱板及反相C-18（Rp-18）柱色谱用硅胶（德国Merck公司），柱层析硅胶G（青岛海洋化工厂分厂），薄层层析硅胶板GF254（青岛普科分离材料有限公司）；石油醚、乙酸乙酯、乙醇均为工业级，使用前重蒸；无水乙醇（分析纯，重庆川东化工集团有限公司）；色谱用乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为市售娃哈哈纯净水。 1.1.3
研究对象。华中五味子药材购于贵阳三桥药材市场，经贵阳中医学院董立莎教授鉴定为华中五味子（Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.）的干燥成熟果实。
1.2 方法
1.2.1
不同产地药材中五味子酚的提取。分别称取不同华中五味子干燥果实500 g，粉粹成粗粉（过40目筛），95%乙醇（1 L/次）加热回流提取3次，提取时间分别为4、3和2 h，减压过滤，合并提取液，真空减压浓缩后得浸膏。
1.2.2
对照品和供试品溶液的制备。精密称取五味子酚对照品10 mg，置10 ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得五味子酚对照品储备液。精密称取各产地五味子酚粗提取物100 mg，置10 ml容量瓶中，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀。微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得供试品溶液。
1.2.3
色谱条件。Kromasil C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-水（B）（80∶20）为流动相，流速1.0 ml/min， 柱温30 ℃，紫外检测波长254 nm，进样量1 μl。
1.2.4
样品含量测定。取供试品溶液，按照“1.2.3”项的色谱条件，测定不同产地五味子药材中五味子酚的含量。
1.2.5
五味子酚提取物的制备。选取五味子酚含量最高的五味子药材为原料，按照“1.2.1”方法制备五味子酚提取物浸膏。
1.2.6
五味子酚的制备。
1.2.6.1
正相硅胶柱层析法分离。柱层析用玻璃柱（内径×长度，600 mm×1 300 mm）洗净烘干备用。采用湿法装柱、干法上样的柱层析技术。柱层析用硅胶（200～300目，3 kg）分批加入装有石油醚的烧杯中，搅拌，除去硅胶表面附着的气泡。玻璃柱内先加入少量棉花垫在底部，随后注入工业重蒸石油醚（1 L），再将处理过的硅胶匀浆缓缓连续地加入色谱柱，装填时微开色谱柱底部活塞，轻轻敲打柱身，使之装填均匀，整个过程始终保持色谱柱内的液面高于硅胶面。装柱后平衡色谱柱4～5 h，最后保持色谱柱中液面高于硅胶面约2～3 cm。同时将上述五味子酚提取浸膏用少量无水乙醇溶解，加2倍样品量硅胶（40～80 目）拌样，待吸附样品的硅胶完全干燥后，加至平衡好的玻璃色谱柱上端，始终保持液面高于硅胶面。用洗脱溶剂石油醚-乙酸乙酯（3∶1）混合系统洗脱，至4倍柱体积（约17 L）时，通过薄层层析（TLC）检测到五味子酚开始被洗脱下来；继续洗脱至7.5 倍柱体积后，TLC法检测不到五味子酚，浓缩洗脱液，得五味子酚粗品。
1.2.6.2
反相硅胶柱层析法纯化。用反相硅胶柱层析法纯化上述五味子酚粗品，将Rp-18柱色谱用硅胶用甲醇浸泡过夜后，除去气泡，装入玻璃色谱柱（内径×长度，46 mm × 457 mm）。装柱平衡后，置换成50%甲醇-水溶剂体系。同时将五味子酚粗品溶于甲醇中，用干燥Rp-18柱色谱用硅胶进行拌样。待色谱柱完全平衡后，当反相柱的液面与Rp-18柱色谱用硅胶面相平时，将吸附五味子酚粗品的Rp-18硅胶加至上述已平衡好的玻璃柱顶端。用甲醇-水溶液梯度洗脱，依次用不同比例的甲醇-水溶液（50∶50和60∶40）分别冲洗约200 ml，洗脱液真空减压浓缩至干，TLC法检测浓缩物中均无五味子酚；继续用甲醇-水（70∶30）混合溶液冲洗约360 ml，洗脱液浓缩物TLC法检测，纯的五味子酚开始被洗脱出来，用甲醇-水（70∶30）混合溶液约2 000 ml继续洗脱，得到高纯度的五味子酚。
1.2.7
五味子酚的纯度检测。将制备得到的五味子酚纯品与五味子酚对照品通过2种互不交叉溶剂展开体系的薄层层析、质谱和NMR等方法进行检测，并按照“1.2.3”色谱条件通过高效液相色谱进一步检测其纯度。
2 结果与分析
2.1 样品含量测定
取不同产地的五味子药材，进行了药材中五味子酚含量的测定，结果表明（表1），样品6中五味子酚的相对含量最高，选用产地6的华中五味子进行五味子酚的制备试验可获取得率相对高的纯品。
2.2 五味子酚的纯度检测
制备的五味子酚纯品经与五味子酚對照品进行2种互不交叉溶剂展开体系（石油醚-乙酸乙酯体系和环己烷-丙酮体系）的薄层层析检测、质谱和NMR对比分析，结果显示其Rf值一致、谱图数据均与对照品一致，故鉴定为五味子酚[13]。分析HPLC图（图1）可知，通过上述方法制备得到的五味子酚纯度可达99.5%以上。
3 讨论
五味子酚具有很好的抗氧化生物活性，文献报道中多以红花五味子和北五味子作为原料药材，其中又以红花五味子中五味子酚的含量较高，但红花五味子的资源有限。该研究利用HPLC方法对不同产地的华中五味子中五味子酚进行含量测定，选出含量最高产地的华中五味子，对其中的五味子酚进行提取和制备，丰富了获得五味子酚的资源和制备方法，该研究的技术方法能较好地为五味子酚化学和生物学的可持续研究提供原料需求，具有重要的实用价值。
参考文献
[1]姚凝.甘肃产华中五味子对实验性肾阴虚型小鼠血清超氧化物歧化酶、活性氧的影响[J].中国中医药信息杂志，2005，12（5）：33，43.
[2] 李莉，刘耕陶.五味子酚对氧自由基引起大鼠脑突触体和线粒体损伤的保护作用[J].药学学报，1998，33（2）：81-86.
[3] 陈淑珍，付阳平，吴若沣.五味子酚对大鼠中性粒细胞呼吸爆发的影响[J].药学学报，2000，35（8）：571-575.
[4] 李莉.五味子酚等三种抗氧化剂对氧化应激损伤中枢神经细胞的保护作用及其作用机理研究[J].生理科学进展，1998，29（1）：35-38.
[5] 余凌虹，刘耕陶.五味子酚对氧化低密度脂蛋白引起的血管内皮细胞及神经细胞损伤的保护作用[J].中国药理通讯，2007，24（3）：51-52.
[6] 李丽波，杨宏艳，周丽.五味子酚对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用[J].中国药理通讯，2013，30（3）：40-41.
[7] 钮心懿，王维君，边振甲，等.五味子有效成分“醇甲”的中枢神经系统作用[J].药学学报，1983，18（6）：416-421 .
[8] 徐丹，周英，穆淑珍.华中五味子化学成分的分离及鉴定[J].山地农业生物学报，2011，30（2）：174-176，184.
[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：227.
[10] 张明华，陈虹，李灵芝，等.五味子甲素和五味子醇甲对四氯化碳所致肝脏损伤的保护作用[J].武警医学，2002，13（7）：395-396.
[11] 上海药物研究所.华中五味子降转氨酶成分的研究[J].生物化学与生物物理学报，1976，8（4）：333-340.
[12] 裴彬，蔡雄，缪晓辉，等.五味子甲素对大鼠肝细胞色素P450 3A影响的研究[J].肝脏，2006，11（4）：261-263.
[13] 王洪结，陈延镛.红花五味子中木脂体成分的化学研究[J].药学学报，1985，20（11）：832.
关键词 华中五味子；五味子酚；提取分离；制备方法
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）22-054-03
Abstract [Objective] To prepare the high purity schisanhenol from Schisandra sphenanthera. [Method] After the chemical constituents of Schisandra sphenanthera with 95% ethanol were extracted， the schisanhenol content in them was detected by HPLC. And schisanhenol with the high purity was prepared from the sample with the high content by positive and reverse phase silica gel column chromatography. [Result] The relative content of schisanhenol in Schisandra sphenanthera collected from Sichuan Province was the most highest. [Conclusion] By positive and reverse phase silica gel column chromatography， high purity schisanhenol could be quickly and easily obtained from Schisandra sphenanthera， which will enrich the resource and preparation method of schisanhenol， and provide the material base for sustainable research on chemistry and biology of schisanhenol.
Key words Schisandra sphenanthera； Schisanhenol； Extraction and separation； Preparation method
五味子酚是紅花五味子（Schisandra rubriflora Rehd. et Wils.）中含量较高的一种活性联苯环辛二烯类木脂素，具有显著的抗氧化活性并可保护氧自由基引起的心脏、肝脏线粒体损伤和神经细胞损伤[1-4]。近几年来的药理学研究表明五味子酚或其衍生物是十分具有开发价值的抗氧化剂[5-7]。但因为红花五味子资源分布有限，果实采集困难，很难获得大量的五味子酚进行进一步的科学研究。因此，扩大获得五味子酚的资源，研究其中获得五味子酚的制备方法对创新药物的可持续性研发具有十分重要的现实意义。
徐丹等首次在华中五味子中分离得到过五味子酚[8]，华中五味子为五味子科五味子属植物华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils. 的干燥成熟果实[9]，商品名为南五味子。南五味子味酸、甘，温，归肺、心、肾经，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等病症，其主要有效成分为联苯环辛二烯类木脂素，有降低血清转氨酶作用。目前华中五味子的果实已在临床上被应用于治疗急慢性肝炎[10-12]。华中五味子在我国主要分布于山西、陕西、甘肃、山东、江苏、安徽、浙江、江西、福建、河南、湖北、湖南、四川、贵州、云南东北部，资源很丰富。笔者在此利用HPLC方法对不同产地的华中五味子中五味子酚进行含量测定，选出含量最高产地的华中五味子，对其中的五味子酚进行提取和制备，丰富了获得五味子酚的资源和制备方法，为五味子酚化学和生物学的可持续研究提供物质基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
仪器。美国Agilent 1100型高校液相色谱仪，OSB-21000旋转蒸发器（上海爱朗仪器有限公司），NOVA 400 MHz超导核磁共振波谱仪（以TMS为内标，美国瓦里安公司），GC-MS 5973型气相色谱-质谱联用仪（美国惠普公司），ME203E型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），ZF-2型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂），98-Ⅰ-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司），DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.1.2
试剂。五味子酚对照品为实验室自制（纯度>99.0%）。反相C-18（Rp-18，粒度 40～63 μm）薄层色谱板及反相C-18（Rp-18）柱色谱用硅胶（德国Merck公司），柱层析硅胶G（青岛海洋化工厂分厂），薄层层析硅胶板GF254（青岛普科分离材料有限公司）；石油醚、乙酸乙酯、乙醇均为工业级，使用前重蒸；无水乙醇（分析纯，重庆川东化工集团有限公司）；色谱用乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为市售娃哈哈纯净水。 1.1.3
研究对象。华中五味子药材购于贵阳三桥药材市场，经贵阳中医学院董立莎教授鉴定为华中五味子（Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.）的干燥成熟果实。
1.2 方法
1.2.1
不同产地药材中五味子酚的提取。分别称取不同华中五味子干燥果实500 g，粉粹成粗粉（过40目筛），95%乙醇（1 L/次）加热回流提取3次，提取时间分别为4、3和2 h，减压过滤，合并提取液，真空减压浓缩后得浸膏。
1.2.2
对照品和供试品溶液的制备。精密称取五味子酚对照品10 mg，置10 ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得五味子酚对照品储备液。精密称取各产地五味子酚粗提取物100 mg，置10 ml容量瓶中，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀。微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得供试品溶液。
1.2.3
色谱条件。Kromasil C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-水（B）（80∶20）为流动相，流速1.0 ml/min， 柱温30 ℃，紫外检测波长254 nm，进样量1 μl。
1.2.4
样品含量测定。取供试品溶液，按照“1.2.3”项的色谱条件，测定不同产地五味子药材中五味子酚的含量。
1.2.5
五味子酚提取物的制备。选取五味子酚含量最高的五味子药材为原料，按照“1.2.1”方法制备五味子酚提取物浸膏。
1.2.6
五味子酚的制备。
1.2.6.1
正相硅胶柱层析法分离。柱层析用玻璃柱（内径×长度，600 mm×1 300 mm）洗净烘干备用。采用湿法装柱、干法上样的柱层析技术。柱层析用硅胶（200～300目，3 kg）分批加入装有石油醚的烧杯中，搅拌，除去硅胶表面附着的气泡。玻璃柱内先加入少量棉花垫在底部，随后注入工业重蒸石油醚（1 L），再将处理过的硅胶匀浆缓缓连续地加入色谱柱，装填时微开色谱柱底部活塞，轻轻敲打柱身，使之装填均匀，整个过程始终保持色谱柱内的液面高于硅胶面。装柱后平衡色谱柱4～5 h，最后保持色谱柱中液面高于硅胶面约2～3 cm。同时将上述五味子酚提取浸膏用少量无水乙醇溶解，加2倍样品量硅胶（40～80 目）拌样，待吸附样品的硅胶完全干燥后，加至平衡好的玻璃色谱柱上端，始终保持液面高于硅胶面。用洗脱溶剂石油醚-乙酸乙酯（3∶1）混合系统洗脱，至4倍柱体积（约17 L）时，通过薄层层析（TLC）检测到五味子酚开始被洗脱下来；继续洗脱至7.5 倍柱体积后，TLC法检测不到五味子酚，浓缩洗脱液，得五味子酚粗品。
1.2.6.2
反相硅胶柱层析法纯化。用反相硅胶柱层析法纯化上述五味子酚粗品，将Rp-18柱色谱用硅胶用甲醇浸泡过夜后，除去气泡，装入玻璃色谱柱（内径×长度，46 mm × 457 mm）。装柱平衡后，置换成50%甲醇-水溶剂体系。同时将五味子酚粗品溶于甲醇中，用干燥Rp-18柱色谱用硅胶进行拌样。待色谱柱完全平衡后，当反相柱的液面与Rp-18柱色谱用硅胶面相平时，将吸附五味子酚粗品的Rp-18硅胶加至上述已平衡好的玻璃柱顶端。用甲醇-水溶液梯度洗脱，依次用不同比例的甲醇-水溶液（50∶50和60∶40）分别冲洗约200 ml，洗脱液真空减压浓缩至干，TLC法检测浓缩物中均无五味子酚；继续用甲醇-水（70∶30）混合溶液冲洗约360 ml，洗脱液浓缩物TLC法检测，纯的五味子酚开始被洗脱出来，用甲醇-水（70∶30）混合溶液约2 000 ml继续洗脱，得到高纯度的五味子酚。
1.2.7
五味子酚的纯度检测。将制备得到的五味子酚纯品与五味子酚对照品通过2种互不交叉溶剂展开体系的薄层层析、质谱和NMR等方法进行检测，并按照“1.2.3”色谱条件通过高效液相色谱进一步检测其纯度。
2 结果与分析
2.1 样品含量测定
取不同产地的五味子药材，进行了药材中五味子酚含量的测定，结果表明（表1），样品6中五味子酚的相对含量最高，选用产地6的华中五味子进行五味子酚的制备试验可获取得率相对高的纯品。
2.2 五味子酚的纯度检测
制备的五味子酚纯品经与五味子酚對照品进行2种互不交叉溶剂展开体系（石油醚-乙酸乙酯体系和环己烷-丙酮体系）的薄层层析检测、质谱和NMR对比分析，结果显示其Rf值一致、谱图数据均与对照品一致，故鉴定为五味子酚[13]。分析HPLC图（图1）可知，通过上述方法制备得到的五味子酚纯度可达99.5%以上。
3 讨论
五味子酚具有很好的抗氧化生物活性，文献报道中多以红花五味子和北五味子作为原料药材，其中又以红花五味子中五味子酚的含量较高，但红花五味子的资源有限。该研究利用HPLC方法对不同产地的华中五味子中五味子酚进行含量测定，选出含量最高产地的华中五味子，对其中的五味子酚进行提取和制备，丰富了获得五味子酚的资源和制备方法，该研究的技术方法能较好地为五味子酚化学和生物学的可持续研究提供原料需求，具有重要的实用价值。
参考文献
[1]姚凝.甘肃产华中五味子对实验性肾阴虚型小鼠血清超氧化物歧化酶、活性氧的影响[J].中国中医药信息杂志，2005，12（5）：33，43.
[2] 李莉，刘耕陶.五味子酚对氧自由基引起大鼠脑突触体和线粒体损伤的保护作用[J].药学学报，1998，33（2）：81-86.
[3] 陈淑珍，付阳平，吴若沣.五味子酚对大鼠中性粒细胞呼吸爆发的影响[J].药学学报，2000，35（8）：571-575.
[4] 李莉.五味子酚等三种抗氧化剂对氧化应激损伤中枢神经细胞的保护作用及其作用机理研究[J].生理科学进展，1998，29（1）：35-38.
[5] 余凌虹，刘耕陶.五味子酚对氧化低密度脂蛋白引起的血管内皮细胞及神经细胞损伤的保护作用[J].中国药理通讯，2007，24（3）：51-52.
[6] 李丽波，杨宏艳，周丽.五味子酚对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用[J].中国药理通讯，2013，30（3）：40-41.
[7] 钮心懿，王维君，边振甲，等.五味子有效成分“醇甲”的中枢神经系统作用[J].药学学报，1983，18（6）：416-421 .
[8] 徐丹，周英，穆淑珍.华中五味子化学成分的分离及鉴定[J].山地农业生物学报，2011，30（2）：174-176，184.
[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：227.
[10] 张明华，陈虹，李灵芝，等.五味子甲素和五味子醇甲对四氯化碳所致肝脏损伤的保护作用[J].武警医学，2002，13（7）：395-396.
[11] 上海药物研究所.华中五味子降转氨酶成分的研究[J].生物化学与生物物理学报，1976，8（4）：333-340.
[12] 裴彬，蔡雄，缪晓辉，等.五味子甲素对大鼠肝细胞色素P450 3A影响的研究[J].肝脏，2006，11（4）：261-263.
[13] 王洪结，陈延镛.红花五味子中木脂体成分的化学研究[J].药学学报，1985，20（11）：832.