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摘要：目的 研究大孔吸附树脂富集川芪眼用凝胶水提液中有效成分的工艺条件及参数。方法 以黄芪甲苷和阿魏酸为指标成分，采用高效液相色谱法进行含量测定，优选大孔树脂纯化的最佳工艺。结果 D101大孔吸附树脂对待测成分的纯化效果较好，最佳精制工艺条件为：上样浓度为0.3 g原药材/mL，上样量为6倍上样液，洗脱液为6倍树脂量的70%乙醇溶液，动态洗脱流速为6 BV/h。结论 D101大孔吸附树脂纯化川芪眼用凝胶水提液的最佳工艺稳定、可行。
关键词：大孔吸附树脂；黄芪甲苷；阿魏酸；纯化
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.12.020
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）12-0079-05
Study on Extraction Technology of Chuanqi Ophthalmic Gel Purified by Macroporous Resin YU Juan， FENG Wei-hong， DU Mao-bo， SHEN Shuo， LIU Shu-zhi （Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
Abstract：Objective To investigate the technological conditions and parameters of effective components in water extraction of Chuanqi Ophthalmic Gel purified with macroporous resin. Methods The contents of astragaloside and ferulic acid were set as indexes and determined by HPLC， with a purpose to evaluate the optimal macroporous resin purification process. Results The optimal macroporous resin is D101. The optimal purification technology is as follows：The sample concentration is 0.3 g crude drug/mL；the amount of resin-like fluid is 6 BV；dynamic adsorption flow rate is 6 BV/h；concentration eluenta is 70% ethanol；the amount of eluenta fluid is 6 BV. Conclusion The technology of D101 macroporous resin for purification of water extraction Chuanqi Ophthalmic Gel is stable and feasible.
Key words：macroporous resin；astragaloside；ferulic acid；purification
益气活血类中药对眼底疾病具有良好疗效，而黄芪、川芎是最常用的药味。以黄芪、川芎组方的川芪眼用凝胶为模型药进行水提或醇提工艺研究，由于中药复方成分复杂，有效成分相对含量低，需要选择适宜的提取与纯化方法及条件，对组方进行精制，使有效成分富集。本试验以黄芪有效成分黄芪甲苷、川芎有效成分阿魏酸为评价指标，研究大孔吸附树脂纯化川芪眼用凝胶水提液的工艺条件。
1 仪器与试药
Waters H-Class UPLC H-Class Core System（美国Waters），Agilent Technologies 1200 series高相液相色谱仪（美国Agilent），蒸发光检测器（ELSD 2000ES，Alltech），Sartorius BP211D电子天平（德国
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81373977）
通讯作者：刘淑芝，E-mail：Liushuzhi2004@sina.com
Sartorius公司），恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）。
黄芪饮片（批号140116001）、川芎饮片（批号140124007）购自北京纤草中药饮片有限公司，阿魏酸对照品（批号110773-201012）、黄芪甲苷对照品（批号110781-200613）购自中国食品药品检定研究院。大孔树脂D101、AB-8、HPD100、HPD400、HPD600和HPD826购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。甲醇（HPLC级，Fisher公司），乙腈（HPLC级，Fisher公司，美国），哇哈哈纯净水，冰醋酸、正丁醇、氨水等均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 阿魏酸含量测定
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品1.02 mg，加70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得阿魏酸浓度为0.102 mg/mL的溶液，备用。
2.1.2 供试品溶液的制备 取大孔树脂洗脱液，过0.22 μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液，即得。
2.1.3 色谱条件 Waters Acquity UPLC H-Class Core System，Acquity UPLC PDA Detector，Empower3色谱工作站；Acquity UPLC? BEH C18色谱柱（1.7 μm， 2.1 mm×50 mm），流动相为甲醇-0.1%醋酸水溶液（20∶80），流速0.6 mL/min，柱温30 ℃，检测波长321 nm，进样量0.2 ?L。 2.1.4 标准曲线的制备 取阿魏酸对照品溶液0.1、0.6、1、2、10 ?L进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程为Y=8777.1X-32 837，r=1 （n=5），结果表明在0.010 2～1.02 μg范围内，阿魏酸线性关系良好。
2.1.5 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.1.3”项下方法，连续进样6次，测定阿魏酸峰面积，结果峰面积RSD=2.16%，表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.1.3”项下方法，分别于制备后0、1、2、6、8、24 h进样，测定阿魏酸峰面积，结果峰面积RSD=2.49%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定。
2.1.7 重复性试验 按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件分别进样，测定阿魏酸含量，原样品中阿魏酸含量平均值为0.092 9 mg/mL，RSD=0.937%，表明方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的供试品溶液各1 mL，平行6份，按样品中阿魏酸的含量加入对照品溶液（0.09 mg/mL）1 mL，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.1.3”项下色谱条件进行测定。结果供试品溶液中阿魏酸的平均回收率为97.66%，RSD=1.53%，表明方法的准确度良好，见表1。
表1 阿魏酸加样回收率试验
2.2 黄芪甲苷含量测定
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品4.46 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得黄芪甲苷浓度为0.446 mg/mL，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取大孔树脂洗脱液，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次10 mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
2.2.3 色谱条件 Agilent Technologies 1200 series高效液相色谱仪，Diamonsil C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），柱温25 ℃，流动相为乙腈-水（32∶68），流速1.0 mL/min，蒸发光散射检测器漂移管温度109 ℃，气流流量2.9 mL/min，进样量0.5 ?L。
2.2.4 标准曲线的制备 取黄芪甲苷对照品溶液分别进样0.1、0.5、1、5、20 μL，分别以待测成分的进样质量（黄芪甲苷为质量的常用对数）为横坐标，峰面积（黄芪甲苷为峰面积的常用对数）为纵坐标，得回归方程为Y=1.315 3X+6.311 2，r=0.998 9（n=5），结果表明在0.044 6～8.92 μg范围内，黄芪甲苷线性关系良好。
2.2.5 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.2.3”项下方法，连续进样6次，测定黄芪甲苷峰面积，黄芪甲苷峰面积对数的RSD=0.128%，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.2.3”项下方法，分别于供试品溶液制备后0、1、2、6、8、24 h进样，测定黄芪甲苷峰面积，黄芪甲苷峰面积常用对数的RSD=0.143%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定。
2.2.7 重复性试验 平行制备6份供试品溶液，按“2.2.3”项下方法，分别进样，测定黄芪甲苷含量，结果原样品中黄芪甲苷含量的平均值为1.736 mg/mL， RSD=1.500%，表明方法的重复性良好。
2.2.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的供试品溶液各1 mL，平行6份，按样品中黄芪甲苷的含量加入对照品溶液（1.8 mg/mL）1 mL，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.2.3”项下色谱条件进行测定。结果供试品溶液中黄芪甲苷的平均回收率为102.78%，RSD=1.28%，表明方法的准确度良好，见表2。
表2 黄芪甲苷加样回收率试验
2.3 分离纯化工艺
2.3.1 上样液的制备 取川芎饮片适量，提取挥发油后，药渣与黄芪饮片合并，加10倍量水加热回流提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，浓缩至一定浓度后，4000 r/min离心20 min，取上清液，得到样品溶液（上清液∶原药材=3∶1）。
2.3.2 大孔树脂预处理与装柱 大孔树脂D101、AB-8、HPD100、HPD400、HPD600、HPD826用水洗除去上浮树脂碎片和杂物，以95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀后，用湿法装柱，继续用95%乙醇以适当流速通过树脂柱，洗至流出液与水（1∶5）混合不呈浑浊，再用水洗至无醇味，备用。
2.3.3 大孔树脂型号筛选 取预处理好的D101[1-2]、AB-8[3-4]、HPD100[5]、HPD400[6]、HPD600[3]、HPD826[7]大孔树脂5 mL（均为湿树脂），分别装于100 mL锥形瓶中。取样品溶液50 mL，以120 r/min振摇24 h，使其饱和吸附。分别装于同一规格层析柱（径高比为1∶6[8]）中，30 mL蒸馏水洗树脂，再用70%乙醇[4]80 mL以流速1 mL/min[2]进行洗脱，收集洗脱液，测定阿魏酸和黄芪甲苷含量，计算解吸率，结果见表3。可见，HPD100和D101对黄芪甲苷和阿魏酸的吸附量最大，但D101对2种成分的解析率较HPD100高，综合以上结果，最终选择D101大孔树脂。
表3 不同型号大孔树脂对指标成分吸附和解吸的影响
注：吸附量（mg/mL）=（上样液含量-流出液含量）÷树脂体积；
解吸量（mg/mL）=洗脱液浓度×洗脱液体积÷树脂体积； 解吸率（%）=解吸量÷吸附量×100%（下同）
2.3.4 上样液浓度的考察 取3份D101树脂10 mL装柱，将相当于20 g药材的上样液分别浓缩至含原药材0.2、0.3、0.4 g/mL，以1 mL/min流速动态吸附。测定上样液、流出液中阿魏酸和黄芪甲苷的含量，计算阿魏酸和黄芪甲苷的吸附率，结果见表4。可见，上样液浓度对黄芪甲苷的吸附率影响不大，随着上样浓度的升高阿魏酸的吸附率呈下降趋势，但是以0.2、0.3 g原药材/mL的浓度上样，阿魏酸的吸附率相近，考虑到上样浓度为0.3 g原药材/mL较0.2 g原药材/mL大大缩短上样时间，提高生产效率，因此，确定上样浓度为0.3 g原药材/mL。
表4 不同上样液浓度对阿魏酸和黄芪甲苷吸附率的影响
注：吸附率（%）=吸附量÷上样液含量×100%
2.3.5 上样量的确定 取一定量预处理过的D101型大孔吸附树脂，湿法装柱，径高比为1∶6，即1 BV=10 mL。将粗提液以1 mL/min流速进行动态吸附，分段收集流出液，每段30 mL即3 BV，测定流出液中阿魏酸和黄芪甲苷的含量，绘制阿魏酸、黄芪甲苷泄露曲线，结果见图1。可以看出，随着上样液体积的增加，流经树脂的流出液中阿魏酸和黄芪甲苷的量逐渐增加，但阿魏酸的泄漏点较黄芪甲苷提前出现，为避免药液损失，上样量的确定以阿魏酸的泄漏点出现为准。
由于阿魏酸的分析灵敏度较黄芪甲苷高，每份流出液体积偏大，可能会造成上样量确定误差，因此，每1 BV（即1倍树脂床体积，10 mL）流出液收集1份，按上述方法测定各份流出液中阿魏酸的含量，绘制阿魏酸的泄漏曲线，见图2。在流出液为第6倍床体积时泄漏点出现，因此选择上样量为6倍床体积，即60 mL。
图1 黄芪甲苷、阿魏酸泄漏曲线
图2 阿魏酸泄漏曲线
2.3.6 洗脱溶剂的考察 取已处理好的D10l树脂装柱，将6 BV上样液以1 mL/min流速通过树脂柱，完全吸附后，静置2 h。先用30 mL水洗，再依次用10%、30%、50%、70%和90%乙醇各50 mL以1 mL/min流速洗脱，收集各洗脱液，测定阿魏酸和黄芪甲苷的含量，确定最佳洗脱溶剂浓度，结果见表5。可以看出，随着乙醇体积分数的增加，阿魏酸和黄芪甲苷的解吸率总体呈上升趋势。乙醇的体积分数越小，极性越大，越不利于解吸。由于阿魏酸极性强，黄芪甲苷类物质除糖苷键外还具有羟基结构使总体呈弱极性，所以在相同的乙醇体积分数下，阿魏酸较黄芪甲苷易解析。乙醇浓度在10%～30%之间，随着乙醇体积分数的增加，阿魏酸解吸率呈上升趋势，而黄芪甲苷却未被解析下来，70%乙醇对阿魏酸和黄芪甲苷的解析均较好，故最终将洗脱浓度定为70%。
表5 乙醇浓度对阿魏酸和黄芪甲苷洗脱的影响
2.3.7 洗脱流速的确定 取已处理好的D10l树脂装柱，将6 BV上样液以1 mL/min流速通过树脂柱，完全吸附后，静置2 h。先用30 mL水洗，再用70%乙醇50 mL进行洗脱，洗脱流速分别为4、6、8 BV/h，收集醇洗脱液，测定阿魏酸和黄芪甲苷的量，考察流速对树脂解吸量的影响，结果见表6。可见，中流速（6 BV/h）对阿魏酸具有较大的解吸率。4、6 BV/h的流速洗脱对黄芪甲苷有较大的吸附率但二者解吸率差别不大，综合考虑，最终将洗脱流速确定为6 BV/h。
表6 洗脱流速对黄芪甲苷和阿魏酸洗脱的影响
2.3.8 洗脱曲线的考察 取已处理好的D10l树脂装柱，将6 BV上样液以1 mL/min流速通过树脂柱，完全吸附后，静置2 h[9]。先用30 mL水洗，再用70%乙醇150 mL进行洗脱，分段收集洗脱液，每份10 mL，共收集15份，测定其中阿魏酸和黄芪甲苷的含量，以阿魏酸和黄芪甲苷的浓度和份数绘制洗脱曲线，见图3。从洗脱液用量对解吸的影响结果可以看出，解吸率随着洗脱剂用量的增加而增加，阿魏酸在第6份样时洗脱完全，即洗脱剂用量超过60 mL时解吸率上升趋于平缓，黄芪甲苷在第7份样时即洗脱剂用量超过70 mL基本洗脱完全。理论上，洗脱剂用量越多，化合物解吸越完全，但树脂洗脱之后洗脱液浓缩过程中，过量的洗脱剂给后续处理带来不便。因此，希望操作过程中用尽量少的洗脱液，以得到体积小、浓度高的洗脱液。所以选择截至第6流份的乙醇用量作为洗脱溶剂的体积，确定最佳洗脱溶剂用量为60 mL，即6倍量树脂。
图3 黄芪甲苷、阿魏酸洗脱曲线
2.3.9 验证试验 根据确定的大孔树脂精制条件制备3批样品，测定其中黄芪甲苷和阿魏酸含量，对优化条件进行验证。结果表明，工艺基本稳定，重复性良好，见表7。
表7 纯化工艺验证试验（n=3）
3 讨论
本试验针对川芎和黄芪合体液的水溶性部分上同一大孔树脂柱进行纯化，以阿魏酸和黄芪甲苷作为指标，对纯化工艺进行筛选。从上样量确定的试验结果可知，阿魏酸在D101树脂上的泄漏明显快于黄芪甲苷，表明阿魏酸的吸附性能较黄芪甲苷弱。这可能是阿魏酸极性大于黄芪甲苷使其在弱极性的D101树脂上的吸附性降低所致。因此，在采用D101树脂纯化川芪水提液时宜选择吸附性较小的阿魏酸作为上样量的确定指标，从而避免上样液的损失。
经工艺筛选得到最佳精制工艺为：选用D101大孔树脂，径高比为1∶6[8]，上样液浓度为0.3 g原药材/mL，上样体积6 BV，加70%乙醇6 BV，以6 BV/h洗脱。该条件下最大吸附量为每毫升D101型大孔树脂吸附
祖卡木颗粒是维吾尔医临床常用药，由山柰、睡莲花、甘草、破布木果、薄荷、大枣、洋甘菊、蜀葵子、大黄、罂粟壳10种药材组成，有调节异常气质、清热、发汗、通窍功效，用于感冒咳嗽、发热无汗、咽喉肿痛、鼻塞流涕，临床疗效较好[1-2]。制剂中甘草具有治疗咳嗽和咽喉肿痛作用。由于基础研究薄弱，原标准仅对罂粟壳进行薄层鉴别和含量测定，对甘草和大黄进行薄层鉴别，缺乏方中重要成分含量测定[3-6]。为更好控制祖卡木颗粒的质量，笔者对制剂中甘草质量标准进行研究，采用高效液相色谱法（HPLC）测定甘草苷和甘草酸铵含量。 1 仪器与试药
美国安捷伦1260高效液相色谱仪（四元梯度泵、自动进样器、1260-DAD检测器），SY-1200超声波溶解仪器（天津超声波仪器有限公司），XS-205十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler），AE-240电子天平（四川时运成套仪器有限公司），VE-AS系列超纯水系统（沃尔奇环保股份有限公司）。
祖卡木颗粒（新疆维吾尔药业有限公司，批号分别为150101、140743、1311681）。甘草酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110731-201013），甘草苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111610- 201104）。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Amethyst-C18色谱柱（250 mm×4.60 mm， 5 μm）；流动相：A为乙腈，B为0.05%磷酸溶液，按表1程序梯度洗脱；柱温：30 ℃；检测波长：237 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。理论塔板数按甘草酸峰计算应不低于5000。
表1 流动相梯度洗脱程序
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取甘草苷对照品10.97 mg、甘草酸铵对照品11.12 mg，分别置于50 mL量瓶中，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，精密量取各5 mL，置于同一50 mL量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取样品，研细，精密称定10 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4 线性关系考察
精密量取上述甘草苷和甘草酸铵的混合对照溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，注入液相色谱仪，测定。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得标准曲线方程。甘草苷：Y=14.566 0X-0.501 6， r2=0.999 9，表明甘草苷在0.043 88～0.438 8 μg范围内呈良好线性关系。甘草酸铵：Y=6.729 0X+1.330 6， r2=0.999 4，表明甘草苷在0.044 48～0.444 8 μg范围内呈良好线性关系。
2.5 阴性试验
按样品工艺制备缺甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，进样20 μL，结果在HPLC图中，与甘草相应位置上没有吸收峰，表明其他成分对甘草测定无干扰。色谱图见图1。
A
B
注：A.对照品；B.供试品；1.甘草苷；2.甘草酸铵
图1 祖卡木颗粒中甘草苷、甘草酸铵HPLC图
2.6 精密度试验
精密量取混合对照品溶液（甘草苷0.021 94 mg/mL、甘草0.222 4 mg/mL），重复进样5次，每次20 μL，求得甘草苷RSD=0.16%，甘草酸铵RSD=0.08%。表明精密度良好。
2.7 重复性试验
取同一批样品（批号150101）5份，按供试品溶液制备方法制备并测定甘草苷和甘草酸铵含量，结果甘草苷含量RSD=0.85%，甘草酸铵含量RSD=1.09%。表明本方法重复性良好。
2.8 稳定性试验
取同一批号（批号140743）供试品溶液，分别于2、12、24、36、48 h进样测定，计算甘草苷和甘草酸铵峰面积，结果甘草苷峰面积RSD=0.93%，甘草酸铵峰面积RSD=1.65%。表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.9 加样回收率试验
精密称取供试品（批号1311681）10 g，按供试品溶液制备方法制备，共5份，分别精密加入上述混合对照品溶液5.0 mL，进样20 μL，测定。结果甘草苷平均回收率为97.56%（RSD=0.90%），甘草酸铵平均回收率为100.59%（RSD=1.02%），见表2、表3。
表2 甘草苷加样回收率试验
表3 甘草酸铵加样回收率试验
2.10 样品含量测定
分别精密量取对照品溶液与供试品溶液20 μL，按上述色谱条件进行测定，结果3批样品（批号分别为201311247、201311054、201310201）中甘草苷平均含量为0.242 5 mg（RSD=1.66%），甘草酸铵平均含量为0.094 6 mg（RSD=0.95%），结果见表4。
表4 样品含量测定结果（mg）
3 讨论
本试验考察了不同流动相（乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱、乙腈-水=19∶81、乙腈-醋酸铵溶液梯度洗脱、甲醇-水-冰醋酸=79∶20∶1、乙腈-0.05%甲酸溶液梯度洗脱），经比较分离效果和基线平稳情况，确定乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相。在本试验采用的梯度洗脱系统下，样品色谱中2个成分峰形好，出峰时间比较快，与杂质峰的分离度均大于1.5。
供试品溶液制备中，考察了不同溶剂（30%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、甲醇、50%甲醇、流动相=19∶81、流动相=50∶50）、不同提取方法（索氏提取、加热回流及超声提取30、45 min）的提取效果。结果确定用70%乙醇超声提取30 min溶解稀释后，用0.45 μm微孔滤膜过滤，进样测定，方法简便，节省提取时间[7-10]。
分别取甘草苷、甘草酸铵对照品溶液进行190～700 nm全波长扫描，发现在紫外波长276、250、237 nm有最大吸收，结合本试验采用二极管阵列紫外检测器，在276 nm检测甘草苷，在250 nm检测甘草酸铵。经试验，在237 nm各成分都有最大吸收，便于对各成分含量进行准确测定。
本研究采用HPLC同时测定维吾尔药祖卡木颗粒中甘草酸铵和甘草苷的含量，方法灵敏度高、重复性好，样品处理简单，为制剂中甘草的质量评价提供了简捷有效的检测方法。
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（收稿日期：2015-05-20）
（修回日期：2015-06-12；编辑：陈静）
关键词：大孔吸附树脂；黄芪甲苷；阿魏酸；纯化
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.12.020
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）12-0079-05
Study on Extraction Technology of Chuanqi Ophthalmic Gel Purified by Macroporous Resin YU Juan， FENG Wei-hong， DU Mao-bo， SHEN Shuo， LIU Shu-zhi （Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
Abstract：Objective To investigate the technological conditions and parameters of effective components in water extraction of Chuanqi Ophthalmic Gel purified with macroporous resin. Methods The contents of astragaloside and ferulic acid were set as indexes and determined by HPLC， with a purpose to evaluate the optimal macroporous resin purification process. Results The optimal macroporous resin is D101. The optimal purification technology is as follows：The sample concentration is 0.3 g crude drug/mL；the amount of resin-like fluid is 6 BV；dynamic adsorption flow rate is 6 BV/h；concentration eluenta is 70% ethanol；the amount of eluenta fluid is 6 BV. Conclusion The technology of D101 macroporous resin for purification of water extraction Chuanqi Ophthalmic Gel is stable and feasible.
Key words：macroporous resin；astragaloside；ferulic acid；purification
益气活血类中药对眼底疾病具有良好疗效，而黄芪、川芎是最常用的药味。以黄芪、川芎组方的川芪眼用凝胶为模型药进行水提或醇提工艺研究，由于中药复方成分复杂，有效成分相对含量低，需要选择适宜的提取与纯化方法及条件，对组方进行精制，使有效成分富集。本试验以黄芪有效成分黄芪甲苷、川芎有效成分阿魏酸为评价指标，研究大孔吸附树脂纯化川芪眼用凝胶水提液的工艺条件。
1 仪器与试药
Waters H-Class UPLC H-Class Core System（美国Waters），Agilent Technologies 1200 series高相液相色谱仪（美国Agilent），蒸发光检测器（ELSD 2000ES，Alltech），Sartorius BP211D电子天平（德国
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81373977）
通讯作者：刘淑芝，E-mail：Liushuzhi2004@sina.com
Sartorius公司），恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）。
黄芪饮片（批号140116001）、川芎饮片（批号140124007）购自北京纤草中药饮片有限公司，阿魏酸对照品（批号110773-201012）、黄芪甲苷对照品（批号110781-200613）购自中国食品药品检定研究院。大孔树脂D101、AB-8、HPD100、HPD400、HPD600和HPD826购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。甲醇（HPLC级，Fisher公司），乙腈（HPLC级，Fisher公司，美国），哇哈哈纯净水，冰醋酸、正丁醇、氨水等均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 阿魏酸含量测定
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品1.02 mg，加70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得阿魏酸浓度为0.102 mg/mL的溶液，备用。
2.1.2 供试品溶液的制备 取大孔树脂洗脱液，过0.22 μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液，即得。
2.1.3 色谱条件 Waters Acquity UPLC H-Class Core System，Acquity UPLC PDA Detector，Empower3色谱工作站；Acquity UPLC? BEH C18色谱柱（1.7 μm， 2.1 mm×50 mm），流动相为甲醇-0.1%醋酸水溶液（20∶80），流速0.6 mL/min，柱温30 ℃，检测波长321 nm，进样量0.2 ?L。 2.1.4 标准曲线的制备 取阿魏酸对照品溶液0.1、0.6、1、2、10 ?L进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程为Y=8777.1X-32 837，r=1 （n=5），结果表明在0.010 2～1.02 μg范围内，阿魏酸线性关系良好。
2.1.5 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.1.3”项下方法，连续进样6次，测定阿魏酸峰面积，结果峰面积RSD=2.16%，表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.1.3”项下方法，分别于制备后0、1、2、6、8、24 h进样，测定阿魏酸峰面积，结果峰面积RSD=2.49%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定。
2.1.7 重复性试验 按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件分别进样，测定阿魏酸含量，原样品中阿魏酸含量平均值为0.092 9 mg/mL，RSD=0.937%，表明方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的供试品溶液各1 mL，平行6份，按样品中阿魏酸的含量加入对照品溶液（0.09 mg/mL）1 mL，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.1.3”项下色谱条件进行测定。结果供试品溶液中阿魏酸的平均回收率为97.66%，RSD=1.53%，表明方法的准确度良好，见表1。
表1 阿魏酸加样回收率试验
2.2 黄芪甲苷含量测定
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品4.46 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得黄芪甲苷浓度为0.446 mg/mL，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取大孔树脂洗脱液，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次10 mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
2.2.3 色谱条件 Agilent Technologies 1200 series高效液相色谱仪，Diamonsil C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），柱温25 ℃，流动相为乙腈-水（32∶68），流速1.0 mL/min，蒸发光散射检测器漂移管温度109 ℃，气流流量2.9 mL/min，进样量0.5 ?L。
2.2.4 标准曲线的制备 取黄芪甲苷对照品溶液分别进样0.1、0.5、1、5、20 μL，分别以待测成分的进样质量（黄芪甲苷为质量的常用对数）为横坐标，峰面积（黄芪甲苷为峰面积的常用对数）为纵坐标，得回归方程为Y=1.315 3X+6.311 2，r=0.998 9（n=5），结果表明在0.044 6～8.92 μg范围内，黄芪甲苷线性关系良好。
2.2.5 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.2.3”项下方法，连续进样6次，测定黄芪甲苷峰面积，黄芪甲苷峰面积对数的RSD=0.128%，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.2.3”项下方法，分别于供试品溶液制备后0、1、2、6、8、24 h进样，测定黄芪甲苷峰面积，黄芪甲苷峰面积常用对数的RSD=0.143%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定。
2.2.7 重复性试验 平行制备6份供试品溶液，按“2.2.3”项下方法，分别进样，测定黄芪甲苷含量，结果原样品中黄芪甲苷含量的平均值为1.736 mg/mL， RSD=1.500%，表明方法的重复性良好。
2.2.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的供试品溶液各1 mL，平行6份，按样品中黄芪甲苷的含量加入对照品溶液（1.8 mg/mL）1 mL，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.2.3”项下色谱条件进行测定。结果供试品溶液中黄芪甲苷的平均回收率为102.78%，RSD=1.28%，表明方法的准确度良好，见表2。
表2 黄芪甲苷加样回收率试验
2.3 分离纯化工艺
2.3.1 上样液的制备 取川芎饮片适量，提取挥发油后，药渣与黄芪饮片合并，加10倍量水加热回流提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，浓缩至一定浓度后，4000 r/min离心20 min，取上清液，得到样品溶液（上清液∶原药材=3∶1）。
2.3.2 大孔树脂预处理与装柱 大孔树脂D101、AB-8、HPD100、HPD400、HPD600、HPD826用水洗除去上浮树脂碎片和杂物，以95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀后，用湿法装柱，继续用95%乙醇以适当流速通过树脂柱，洗至流出液与水（1∶5）混合不呈浑浊，再用水洗至无醇味，备用。
2.3.3 大孔树脂型号筛选 取预处理好的D101[1-2]、AB-8[3-4]、HPD100[5]、HPD400[6]、HPD600[3]、HPD826[7]大孔树脂5 mL（均为湿树脂），分别装于100 mL锥形瓶中。取样品溶液50 mL，以120 r/min振摇24 h，使其饱和吸附。分别装于同一规格层析柱（径高比为1∶6[8]）中，30 mL蒸馏水洗树脂，再用70%乙醇[4]80 mL以流速1 mL/min[2]进行洗脱，收集洗脱液，测定阿魏酸和黄芪甲苷含量，计算解吸率，结果见表3。可见，HPD100和D101对黄芪甲苷和阿魏酸的吸附量最大，但D101对2种成分的解析率较HPD100高，综合以上结果，最终选择D101大孔树脂。
表3 不同型号大孔树脂对指标成分吸附和解吸的影响
注：吸附量（mg/mL）=（上样液含量-流出液含量）÷树脂体积；
解吸量（mg/mL）=洗脱液浓度×洗脱液体积÷树脂体积； 解吸率（%）=解吸量÷吸附量×100%（下同）
2.3.4 上样液浓度的考察 取3份D101树脂10 mL装柱，将相当于20 g药材的上样液分别浓缩至含原药材0.2、0.3、0.4 g/mL，以1 mL/min流速动态吸附。测定上样液、流出液中阿魏酸和黄芪甲苷的含量，计算阿魏酸和黄芪甲苷的吸附率，结果见表4。可见，上样液浓度对黄芪甲苷的吸附率影响不大，随着上样浓度的升高阿魏酸的吸附率呈下降趋势，但是以0.2、0.3 g原药材/mL的浓度上样，阿魏酸的吸附率相近，考虑到上样浓度为0.3 g原药材/mL较0.2 g原药材/mL大大缩短上样时间，提高生产效率，因此，确定上样浓度为0.3 g原药材/mL。
表4 不同上样液浓度对阿魏酸和黄芪甲苷吸附率的影响
注：吸附率（%）=吸附量÷上样液含量×100%
2.3.5 上样量的确定 取一定量预处理过的D101型大孔吸附树脂，湿法装柱，径高比为1∶6，即1 BV=10 mL。将粗提液以1 mL/min流速进行动态吸附，分段收集流出液，每段30 mL即3 BV，测定流出液中阿魏酸和黄芪甲苷的含量，绘制阿魏酸、黄芪甲苷泄露曲线，结果见图1。可以看出，随着上样液体积的增加，流经树脂的流出液中阿魏酸和黄芪甲苷的量逐渐增加，但阿魏酸的泄漏点较黄芪甲苷提前出现，为避免药液损失，上样量的确定以阿魏酸的泄漏点出现为准。
由于阿魏酸的分析灵敏度较黄芪甲苷高，每份流出液体积偏大，可能会造成上样量确定误差，因此，每1 BV（即1倍树脂床体积，10 mL）流出液收集1份，按上述方法测定各份流出液中阿魏酸的含量，绘制阿魏酸的泄漏曲线，见图2。在流出液为第6倍床体积时泄漏点出现，因此选择上样量为6倍床体积，即60 mL。
图1 黄芪甲苷、阿魏酸泄漏曲线
图2 阿魏酸泄漏曲线
2.3.6 洗脱溶剂的考察 取已处理好的D10l树脂装柱，将6 BV上样液以1 mL/min流速通过树脂柱，完全吸附后，静置2 h。先用30 mL水洗，再依次用10%、30%、50%、70%和90%乙醇各50 mL以1 mL/min流速洗脱，收集各洗脱液，测定阿魏酸和黄芪甲苷的含量，确定最佳洗脱溶剂浓度，结果见表5。可以看出，随着乙醇体积分数的增加，阿魏酸和黄芪甲苷的解吸率总体呈上升趋势。乙醇的体积分数越小，极性越大，越不利于解吸。由于阿魏酸极性强，黄芪甲苷类物质除糖苷键外还具有羟基结构使总体呈弱极性，所以在相同的乙醇体积分数下，阿魏酸较黄芪甲苷易解析。乙醇浓度在10%～30%之间，随着乙醇体积分数的增加，阿魏酸解吸率呈上升趋势，而黄芪甲苷却未被解析下来，70%乙醇对阿魏酸和黄芪甲苷的解析均较好，故最终将洗脱浓度定为70%。
表5 乙醇浓度对阿魏酸和黄芪甲苷洗脱的影响
2.3.7 洗脱流速的确定 取已处理好的D10l树脂装柱，将6 BV上样液以1 mL/min流速通过树脂柱，完全吸附后，静置2 h。先用30 mL水洗，再用70%乙醇50 mL进行洗脱，洗脱流速分别为4、6、8 BV/h，收集醇洗脱液，测定阿魏酸和黄芪甲苷的量，考察流速对树脂解吸量的影响，结果见表6。可见，中流速（6 BV/h）对阿魏酸具有较大的解吸率。4、6 BV/h的流速洗脱对黄芪甲苷有较大的吸附率但二者解吸率差别不大，综合考虑，最终将洗脱流速确定为6 BV/h。
表6 洗脱流速对黄芪甲苷和阿魏酸洗脱的影响
2.3.8 洗脱曲线的考察 取已处理好的D10l树脂装柱，将6 BV上样液以1 mL/min流速通过树脂柱，完全吸附后，静置2 h[9]。先用30 mL水洗，再用70%乙醇150 mL进行洗脱，分段收集洗脱液，每份10 mL，共收集15份，测定其中阿魏酸和黄芪甲苷的含量，以阿魏酸和黄芪甲苷的浓度和份数绘制洗脱曲线，见图3。从洗脱液用量对解吸的影响结果可以看出，解吸率随着洗脱剂用量的增加而增加，阿魏酸在第6份样时洗脱完全，即洗脱剂用量超过60 mL时解吸率上升趋于平缓，黄芪甲苷在第7份样时即洗脱剂用量超过70 mL基本洗脱完全。理论上，洗脱剂用量越多，化合物解吸越完全，但树脂洗脱之后洗脱液浓缩过程中，过量的洗脱剂给后续处理带来不便。因此，希望操作过程中用尽量少的洗脱液，以得到体积小、浓度高的洗脱液。所以选择截至第6流份的乙醇用量作为洗脱溶剂的体积，确定最佳洗脱溶剂用量为60 mL，即6倍量树脂。
图3 黄芪甲苷、阿魏酸洗脱曲线
2.3.9 验证试验 根据确定的大孔树脂精制条件制备3批样品，测定其中黄芪甲苷和阿魏酸含量，对优化条件进行验证。结果表明，工艺基本稳定，重复性良好，见表7。
表7 纯化工艺验证试验（n=3）
3 讨论
本试验针对川芎和黄芪合体液的水溶性部分上同一大孔树脂柱进行纯化，以阿魏酸和黄芪甲苷作为指标，对纯化工艺进行筛选。从上样量确定的试验结果可知，阿魏酸在D101树脂上的泄漏明显快于黄芪甲苷，表明阿魏酸的吸附性能较黄芪甲苷弱。这可能是阿魏酸极性大于黄芪甲苷使其在弱极性的D101树脂上的吸附性降低所致。因此，在采用D101树脂纯化川芪水提液时宜选择吸附性较小的阿魏酸作为上样量的确定指标，从而避免上样液的损失。
经工艺筛选得到最佳精制工艺为：选用D101大孔树脂，径高比为1∶6[8]，上样液浓度为0.3 g原药材/mL，上样体积6 BV，加70%乙醇6 BV，以6 BV/h洗脱。该条件下最大吸附量为每毫升D101型大孔树脂吸附
祖卡木颗粒是维吾尔医临床常用药，由山柰、睡莲花、甘草、破布木果、薄荷、大枣、洋甘菊、蜀葵子、大黄、罂粟壳10种药材组成，有调节异常气质、清热、发汗、通窍功效，用于感冒咳嗽、发热无汗、咽喉肿痛、鼻塞流涕，临床疗效较好[1-2]。制剂中甘草具有治疗咳嗽和咽喉肿痛作用。由于基础研究薄弱，原标准仅对罂粟壳进行薄层鉴别和含量测定，对甘草和大黄进行薄层鉴别，缺乏方中重要成分含量测定[3-6]。为更好控制祖卡木颗粒的质量，笔者对制剂中甘草质量标准进行研究，采用高效液相色谱法（HPLC）测定甘草苷和甘草酸铵含量。 1 仪器与试药
美国安捷伦1260高效液相色谱仪（四元梯度泵、自动进样器、1260-DAD检测器），SY-1200超声波溶解仪器（天津超声波仪器有限公司），XS-205十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler），AE-240电子天平（四川时运成套仪器有限公司），VE-AS系列超纯水系统（沃尔奇环保股份有限公司）。
祖卡木颗粒（新疆维吾尔药业有限公司，批号分别为150101、140743、1311681）。甘草酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110731-201013），甘草苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111610- 201104）。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Amethyst-C18色谱柱（250 mm×4.60 mm， 5 μm）；流动相：A为乙腈，B为0.05%磷酸溶液，按表1程序梯度洗脱；柱温：30 ℃；检测波长：237 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。理论塔板数按甘草酸峰计算应不低于5000。
表1 流动相梯度洗脱程序
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取甘草苷对照品10.97 mg、甘草酸铵对照品11.12 mg，分别置于50 mL量瓶中，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，精密量取各5 mL，置于同一50 mL量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取样品，研细，精密称定10 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4 线性关系考察
精密量取上述甘草苷和甘草酸铵的混合对照溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，注入液相色谱仪，测定。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得标准曲线方程。甘草苷：Y=14.566 0X-0.501 6， r2=0.999 9，表明甘草苷在0.043 88～0.438 8 μg范围内呈良好线性关系。甘草酸铵：Y=6.729 0X+1.330 6， r2=0.999 4，表明甘草苷在0.044 48～0.444 8 μg范围内呈良好线性关系。
2.5 阴性试验
按样品工艺制备缺甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，进样20 μL，结果在HPLC图中，与甘草相应位置上没有吸收峰，表明其他成分对甘草测定无干扰。色谱图见图1。
A
B
注：A.对照品；B.供试品；1.甘草苷；2.甘草酸铵
图1 祖卡木颗粒中甘草苷、甘草酸铵HPLC图
2.6 精密度试验
精密量取混合对照品溶液（甘草苷0.021 94 mg/mL、甘草0.222 4 mg/mL），重复进样5次，每次20 μL，求得甘草苷RSD=0.16%，甘草酸铵RSD=0.08%。表明精密度良好。
2.7 重复性试验
取同一批样品（批号150101）5份，按供试品溶液制备方法制备并测定甘草苷和甘草酸铵含量，结果甘草苷含量RSD=0.85%，甘草酸铵含量RSD=1.09%。表明本方法重复性良好。
2.8 稳定性试验
取同一批号（批号140743）供试品溶液，分别于2、12、24、36、48 h进样测定，计算甘草苷和甘草酸铵峰面积，结果甘草苷峰面积RSD=0.93%，甘草酸铵峰面积RSD=1.65%。表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.9 加样回收率试验
精密称取供试品（批号1311681）10 g，按供试品溶液制备方法制备，共5份，分别精密加入上述混合对照品溶液5.0 mL，进样20 μL，测定。结果甘草苷平均回收率为97.56%（RSD=0.90%），甘草酸铵平均回收率为100.59%（RSD=1.02%），见表2、表3。
表2 甘草苷加样回收率试验
表3 甘草酸铵加样回收率试验
2.10 样品含量测定
分别精密量取对照品溶液与供试品溶液20 μL，按上述色谱条件进行测定，结果3批样品（批号分别为201311247、201311054、201310201）中甘草苷平均含量为0.242 5 mg（RSD=1.66%），甘草酸铵平均含量为0.094 6 mg（RSD=0.95%），结果见表4。
表4 样品含量测定结果（mg）
3 讨论
本试验考察了不同流动相（乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱、乙腈-水=19∶81、乙腈-醋酸铵溶液梯度洗脱、甲醇-水-冰醋酸=79∶20∶1、乙腈-0.05%甲酸溶液梯度洗脱），经比较分离效果和基线平稳情况，确定乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相。在本试验采用的梯度洗脱系统下，样品色谱中2个成分峰形好，出峰时间比较快，与杂质峰的分离度均大于1.5。
供试品溶液制备中，考察了不同溶剂（30%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、甲醇、50%甲醇、流动相=19∶81、流动相=50∶50）、不同提取方法（索氏提取、加热回流及超声提取30、45 min）的提取效果。结果确定用70%乙醇超声提取30 min溶解稀释后，用0.45 μm微孔滤膜过滤，进样测定，方法简便，节省提取时间[7-10]。
分别取甘草苷、甘草酸铵对照品溶液进行190～700 nm全波长扫描，发现在紫外波长276、250、237 nm有最大吸收，结合本试验采用二极管阵列紫外检测器，在276 nm检测甘草苷，在250 nm检测甘草酸铵。经试验，在237 nm各成分都有最大吸收，便于对各成分含量进行准确测定。
本研究采用HPLC同时测定维吾尔药祖卡木颗粒中甘草酸铵和甘草苷的含量，方法灵敏度高、重复性好，样品处理简单，为制剂中甘草的质量评价提供了简捷有效的检测方法。
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（收稿日期：2015-05-20）
（修回日期：2015-06-12；编辑：陈静）