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摘要：生物素作为人体需要的维生素之一，近年来受到了广泛关注，与此同时，生物素测定方法的研究也取得了迅速发展。为建立一种快速测定生物素的方法，本文研究了微生物法测定大米中生物素的含量。实验利用植物乳杆菌生长与生物素含量成一定的线性关系，通过测定培养后菌液吸光度的变化得出大米中生物素的含量。
关键词：微生物法；生物素；标准曲线；重复性
引言
生物素又称维生素H、维生素B 7，属于含硫的一种维生素，是生物体生长发育必需的一种营养素。它参与机体多种主要的新陈代谢活动，促进细胞的健康和再生，对维护人体皮肤和骨髓的健康、维持生物体的正常生理机能起着重要的作用。此外，生物素还被用作饲料添加剂、植物生长促进剂等，用途十分广泛。而大米作为生活中的主食之一，含有丰富的B 族维生素，能够提供人体所需的维生素。为检测大米中的生物素含量，本文建立了简便检测大米中生物素含量的微生物法，并对此展开实验研究。
1.实验材料与方法
1.1实验材料
选取市售大米为测定材料。
1.2实验试剂与菌種
生物素标准品，浓硫酸，盐酸，氢氧化钠，氯化钠溶液（0.85%），生物素测定用培养基，乳酸杆菌肉汤培养基，植物乳杆菌（ATCC 8014）。
1.3实验仪器
天平，感量0.1 mg；电热鼓风干燥箱，101-A；电热恒温培养箱，DH6000BII；恒温震荡培养箱，HZQ-Fx；离心机；液体分装泵，interscience；pH 计，PB-10；分光光度计，T6 新世纪；超净台，SW-CJ-2FD；移液枪，20-200μL；高压蒸汽灭菌器，MLS-3780。
1.4实验方法
1.4.1实验器皿的准备
将玻璃仪器清洗干净，然后200 ℃干热2 h。
1.4.2实验菌种的制备
将植物乳杆菌（ATCC 8014）甘油管（实验室保存）无菌操作转接至乳酸杆菌肉汤中，37 ℃摇床培养24 h，备用。
1.4.3试样的制备与提取
将大米粉碎、过筛，然后准确称取试样10 g，置于250 mL 锥形瓶中，加入3% 硫酸溶液100 mL，121 ℃水解30 min，冷却后用氢氧化钠溶液调节pH 至4.5，转至250 mL 容量瓶中用水定容至刻度，混匀。用滤纸过滤，弃初滤液，吸取续滤液5 mL，加20 mL 水，混匀，调pH 至6.8，转至100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度。
1.4.4标准曲线制作
取试管分别加入标准工作液（0.1 ng/mL）0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 和标准工作液（0.2 ng/mL）3.0、4.0、5.0 mL 加水至5.0 mL，然后加入5.0 mL 生物素测定用培养基，混匀。每梯度做3 平行[1]。
1.4.5测定系列管的制备
取4 支试管，分别加入1.0、2.0、3.0、4.0 mL 试样提取液，加水至5.0 mL，然后加入5.0 mL 生物素测定用培养基，混匀。每梯度做3 平行。所有试管盖好塞子，与标准曲线管一起121 ℃灭菌5 min。
1.4.6接种液的制备
将活化好的菌种菌悬液离心弃上清，用无菌生理盐水混匀离心弃上清，如此反复3 次。然后用无菌生理盐水稀释至透光率为70%。
1.4.7接种培养
所有试管灭菌后，迅速冷却至室温，无菌操作接入接种液，每支试管接种50 μL，标曲中未接种空白与样品空白除外。置37 ℃培养箱培养20 h。
1.4.8标准曲线的绘制与测定
对每个试管进行目测检查，未接种管（S1）中培养液应是澄清的，若出现混浊，则测定无效。用涡旋混合器充分混合每一支试管后，立即将培养液移入比色皿内进行测定，波长550 nm，待读数稳定后读出吸光度。以生物素标准品的含量为纵坐标，吸光度为横坐标，制作标准曲线[2]。
用接种空白管（S2）为空白，将分光光度计吸光度调为0，读出其他每支试管和样品空白的吸光度。
用每支试管的吸光值计算1mL该编号待测液生物素的含量，并计算该编号待测液的生物素的含量平均值。以此平均值计算全部编号试管的总平均值为Cx，用于计算试样中生物素含量[3]。
式中：X 为试样中生物素的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；Cx 为计算所得的总平均值，单位为微克（μg）；m 为试样的质量，单位为克（g）；f为稀释倍数。
2.结果
2.1标准曲线的绘制
结果培养20 h 后，细菌生长后的吸光度在生物素含量0 ～ 1.0 ng 线性良好，通过电子表格绘制得出标准曲线回归方程：y=0.173 5x2+0.957 7x+0.014 9，r=0.999 1，如图1 所示。
2.2大米中生物素含量的测定重复性试验
按公式计算最终得出，同批次大米样品中，精密称取10 次按方法测定生物素含量结果见表1。
2.3回收率试验
精密称取6 份大米样品，2 份大米样品做平行，其他4 份进行加标，测定并计算回收率，结果见表2。
3.结语
综上所述，利用微生物法可以成为检测大米中生物素含量的一种简易方法。基于上述实验数据分析可知，所测得大米样品生物素含量RSD为0.1%（n=10），平均回收率为97.3%。结果表明：微生物法适用于测定大米中生物素的含量，且方法可靠稳定，重复性好，精密度较高，灵敏度高，且易操作。在今后的工作中，可加强对微生物法的相关研究与探索，以为实现生物素检测的快速化、自动化等提供了参考。
参考文献：
[1]李秋顺，郑晖，孟庆军，等. 生物素的测定方法及应用进展[J]. 食品工业，2012（5）：103-107.
[2]聂炎炎，刘冬虹，吴环，等. 婴幼儿配方奶粉中生物素含量的快速微生物检测方法研究[J]. 检验检疫学刊，2014（6）：36-38.
[3]徐琼，王志伟，陈欣钦，等. 微生物法测定婴幼儿配方乳粉中的生物素、叶酸和VB12[J]. 乳业科学与技术，2014，37（6）：15-17.
关键词：微生物法；生物素；标准曲线；重复性
引言
生物素又称维生素H、维生素B 7，属于含硫的一种维生素，是生物体生长发育必需的一种营养素。它参与机体多种主要的新陈代谢活动，促进细胞的健康和再生，对维护人体皮肤和骨髓的健康、维持生物体的正常生理机能起着重要的作用。此外，生物素还被用作饲料添加剂、植物生长促进剂等，用途十分广泛。而大米作为生活中的主食之一，含有丰富的B 族维生素，能够提供人体所需的维生素。为检测大米中的生物素含量，本文建立了简便检测大米中生物素含量的微生物法，并对此展开实验研究。
1.实验材料与方法
1.1实验材料
选取市售大米为测定材料。
1.2实验试剂与菌種
生物素标准品，浓硫酸，盐酸，氢氧化钠，氯化钠溶液（0.85%），生物素测定用培养基，乳酸杆菌肉汤培养基，植物乳杆菌（ATCC 8014）。
1.3实验仪器
天平，感量0.1 mg；电热鼓风干燥箱，101-A；电热恒温培养箱，DH6000BII；恒温震荡培养箱，HZQ-Fx；离心机；液体分装泵，interscience；pH 计，PB-10；分光光度计，T6 新世纪；超净台，SW-CJ-2FD；移液枪，20-200μL；高压蒸汽灭菌器，MLS-3780。
1.4实验方法
1.4.1实验器皿的准备
将玻璃仪器清洗干净，然后200 ℃干热2 h。
1.4.2实验菌种的制备
将植物乳杆菌（ATCC 8014）甘油管（实验室保存）无菌操作转接至乳酸杆菌肉汤中，37 ℃摇床培养24 h，备用。
1.4.3试样的制备与提取
将大米粉碎、过筛，然后准确称取试样10 g，置于250 mL 锥形瓶中，加入3% 硫酸溶液100 mL，121 ℃水解30 min，冷却后用氢氧化钠溶液调节pH 至4.5，转至250 mL 容量瓶中用水定容至刻度，混匀。用滤纸过滤，弃初滤液，吸取续滤液5 mL，加20 mL 水，混匀，调pH 至6.8，转至100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度。
1.4.4标准曲线制作
取试管分别加入标准工作液（0.1 ng/mL）0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 和标准工作液（0.2 ng/mL）3.0、4.0、5.0 mL 加水至5.0 mL，然后加入5.0 mL 生物素测定用培养基，混匀。每梯度做3 平行[1]。
1.4.5测定系列管的制备
取4 支试管，分别加入1.0、2.0、3.0、4.0 mL 试样提取液，加水至5.0 mL，然后加入5.0 mL 生物素测定用培养基，混匀。每梯度做3 平行。所有试管盖好塞子，与标准曲线管一起121 ℃灭菌5 min。
1.4.6接种液的制备
将活化好的菌种菌悬液离心弃上清，用无菌生理盐水混匀离心弃上清，如此反复3 次。然后用无菌生理盐水稀释至透光率为70%。
1.4.7接种培养
所有试管灭菌后，迅速冷却至室温，无菌操作接入接种液，每支试管接种50 μL，标曲中未接种空白与样品空白除外。置37 ℃培养箱培养20 h。
1.4.8标准曲线的绘制与测定
对每个试管进行目测检查，未接种管（S1）中培养液应是澄清的，若出现混浊，则测定无效。用涡旋混合器充分混合每一支试管后，立即将培养液移入比色皿内进行测定，波长550 nm，待读数稳定后读出吸光度。以生物素标准品的含量为纵坐标，吸光度为横坐标，制作标准曲线[2]。
用接种空白管（S2）为空白，将分光光度计吸光度调为0，读出其他每支试管和样品空白的吸光度。
用每支试管的吸光值计算1mL该编号待测液生物素的含量，并计算该编号待测液的生物素的含量平均值。以此平均值计算全部编号试管的总平均值为Cx，用于计算试样中生物素含量[3]。
式中：X 为试样中生物素的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；Cx 为计算所得的总平均值，单位为微克（μg）；m 为试样的质量，单位为克（g）；f为稀释倍数。
2.结果
2.1标准曲线的绘制
结果培养20 h 后，细菌生长后的吸光度在生物素含量0 ～ 1.0 ng 线性良好，通过电子表格绘制得出标准曲线回归方程：y=0.173 5x2+0.957 7x+0.014 9，r=0.999 1，如图1 所示。
2.2大米中生物素含量的测定重复性试验
按公式计算最终得出，同批次大米样品中，精密称取10 次按方法测定生物素含量结果见表1。
2.3回收率试验
精密称取6 份大米样品，2 份大米样品做平行，其他4 份进行加标，测定并计算回收率，结果见表2。
3.结语
综上所述，利用微生物法可以成为检测大米中生物素含量的一种简易方法。基于上述实验数据分析可知，所测得大米样品生物素含量RSD为0.1%（n=10），平均回收率为97.3%。结果表明：微生物法适用于测定大米中生物素的含量，且方法可靠稳定，重复性好，精密度较高，灵敏度高，且易操作。在今后的工作中，可加强对微生物法的相关研究与探索，以为实现生物素检测的快速化、自动化等提供了参考。
参考文献：
[1]李秋顺，郑晖，孟庆军，等. 生物素的测定方法及应用进展[J]. 食品工业，2012（5）：103-107.
[2]聂炎炎，刘冬虹，吴环，等. 婴幼儿配方奶粉中生物素含量的快速微生物检测方法研究[J]. 检验检疫学刊，2014（6）：36-38.
[3]徐琼，王志伟，陈欣钦，等. 微生物法测定婴幼儿配方乳粉中的生物素、叶酸和VB12[J]. 乳业科学与技术，2014，37（6）：15-17.