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摘要：【目的】比较不同程度CO2脱涩处理的涩柿细胞壁果胶组成差异，分析脱涩对柿果果胶提取率和理化性质的影响，为涩柿果胶的高效提取和应用提供技术支持。【方法】以金瓶柿为试材，分别进行未脱涩处理及采用90%～95% CO2处理15 h后室温放置24 h、处理24 h后室温放置24 h、处理40 h后室温放置48 h 3种脱涩处理。通过福林酚法测定柿果可溶性和不溶性单宁含量，半乳糖醛酸法测定细胞壁果胶组分含量；利用超声波辅助酸提法提取柿果果胶，并分析果胶提取率、色泽、半乳糖醛酸含量、酯化度、单糖组成等理化性质。【结果】随着CO2脱涩处理时间的延长，柿果可溶性单宁含量降低，不溶性单宁含量升高，水溶性果胶含量先降低后升高，螯合性果胶和酸溶性果胶含量先升高后降低；果胶提取率随柿果脱涩程度的提高而升高，90%～95% CO2处理40 h后室温放置48 h的柿果果胶提取率是未脱涩柿果的4.00倍；提取的果胶亮度L*显著降低（P<0.05，下同），半乳糖醛酸含量显著升高；提取的果胶均为高甲氧基果胶，均含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸，其中阿拉伯糖和木糖相对百分含量随着脱涩时间的延长而逐渐降低，半乳糖醛酸相对百分含量则逐渐升高。【结论】CO2脱涩处理可显著提高柿果果胶提取率，并影响提取果胶的理化性质，因此脱涩可作为制备柿果果胶的前处理工序，以90%～95% CO2处理柿果40 h后室温放置48 h的脱涩方式提取得到的果胶品质更佳。
关键词： 柿；CO2脱涩；果胶组成；理化性质；可溶性单宁
中图分类号： S665.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）03-0499-08
0 引言
【研究意义】果胶是植物细胞壁特有的胶体性多糖物質，包括原果胶、果胶和果胶酸，主要对细胞组织起黏合和软化作用。果胶具有良好的凝胶、增稠、稳定和乳化等作用，已在食品、医药、化妆品、纺织等领域广泛应用（王恒禹等，2013）。柿果含有丰富的果胶物质且品质良好（陈佩等，2012），但在果胶提取过程中，涩柿果肉中大量的可溶性单宁与可溶性果胶结合，进而抑制果胶的提取。因此，研究涩柿脱涩过程即可溶性单宁转化为不溶性单宁过程中柿果细胞壁果胶组分、提取率及理化性质的变化，对提高柿果果胶的开发程度和应用价值具有重要意义。【前人研究进展】高浓度CO2处理是一种广泛应用于生产的涩柿脱涩方法（Arnal and Del Río，2003；Besada et al.，2010），其对柿果细胞壁果胶的影响表现在两方面：一是造成细胞壁和原生质膜机械性损伤（Salvador et al.，2007；Novillo et al.，2014），将果胶、单宁等物质释放出来，水溶性果胶与可溶性单宁、阳离子等结合生成难溶于水的果胶组分（Taira et al.，1997；Chang et al.，1999）；二是降低可溶性单宁含量，可增强果胶降解相关酶活性（Field and Lettinga，1992；Asgar et al.，2003；Khademi et al.，2014），促使原果胶降解为可溶性果胶，加速柿果软化（Xu et al.，2004；郭孝辉等，2006；Yakushiji and Nakatsuka，2007）。果胶提取是一个不溶性果胶转化为可溶性果胶和可溶性果胶向液相转移的过程（徐溪，2010）。目前已有利用柿果提取果胶的工艺研究，但多以柿果皮为原料，如利用盐析法（陈栓虎和高全昌，1995）、纤维素酶法（张娜等，2011）、超滤法（王继芝，2013）等，近年来也有筛选具有单宁耐受性的原果胶降解酶菌株的研究（Liu et al.，2012；Taskin，2013），但这些方法能否实现涩柿果实规模化提取果胶还有待进一步研究。【本研究切入点】目前国内外多集中于研究柿果CO2脱涩机理及其生理变化，尚未见有关脱涩过程中细胞壁不同果胶组分及果胶提取率和提取的果胶理化性质变化的研究报道。【拟解决的关键问题】研究不同程度CO2脱涩对柿果细胞壁果胶及果胶提取率和理化性质的影响，旨在为涩柿果胶的高效提取和应用提供技术支持。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试柿果品种为金瓶柿，采自山东省临沂市高桥镇凤凰官庄柿园。采收后3 h内运至山东省果树研究所并立即置于5.0～8.0 ℃冷库中预冷12 h，挑选8～9成熟、大小均匀、色泽金黄的柿果，用10～15 kg聚乙烯保鲜袋包装扎口后，置于温度-1.0～2.0 ℃、湿度80%～90%的冷库中贮藏备用。
甲醇、乙醇、丙酮购自国药集团化学试剂有限公司，均为国产分析纯；98%硫酸、37%盐酸购自天津市永大化学试剂有限公司；福林酚购自北京索莱宝科技有限公司；碳酸钠、四硼酸钠、氢氧化钠等试剂购自天津市凯通化学试剂有限公司。主要仪器设备：ML-204电子天平[梅特勒—托利多国际贸易（上海）有限公司]，UV-2100紫外分光光度计（瑞典Amersham Biosioscience公司），KQ300超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），MS300磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司），5810R高速离心机[艾本德（上海）国际贸易有限公司]，0.22 μm微孔滤膜和膜过滤器（上海兴亚净化材料厂），CR-410色差计（日本Minolta株式会社），ICS-5000离子色谱仪（美国Dionex股份有限公司）。
1. 2 试验设计
将贮藏的柿果平均分成4份进行不同时间的CO2脱涩处理。处理1：未脱涩；处理2：将柿果置于浓度为90%～95% CO2密闭空间内室温脱涩15 h，撤去CO2处理后再室温放置24 h；处理3：将柿果置于90%～95%CO2密闭空间内室温脱涩24 h，撤去CO2处理后再室温放置24 h；处理4：将柿果置于90%～95% CO2密闭空间内室温脱涩40 h，撤去CO2处理后再室温放置48 h。4个不同脱涩程度的柿果分别进行单宁、果胶的测定和果胶提取，每处理重复3次。 1. 3 柿果可溶性和不溶性单宁含量测定
参照Oshida等（1996）的方法提取可溶性和不溶性单宁，采用福林酚法测定单宁含量。单宁含量以没食子酸计。
1. 4 柿果细胞壁果胶组分测定
参照Taira等（1997）和Luo（2007）的方法进行测定。
1. 4. 1 酒精不溶性物质（AIR）制备 取柿果果肉10.0 g，用50 mL 95%乙醇煮沸30 min，冷却后5000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀用30 mL 80%乙醇清洗煮沸30 min，5000 r/min离心15 min，弃上清液，重复操作两次；沉淀再分别用100%乙醇和100%丙酮清洗，洗涤过程中的残渣轻轻捣碎使之不成团，过滤后40 ℃干燥过夜，然后真空包装，即为AIR。
1. 4. 2 水溶性果胶（WSP）提取 称取0.5 g AIR溶于30 mL去离子水中，20 ℃提取过夜，离心（4000 r/min），取上清液；沉淀再次溶于30 mL去离子水中，20 ℃提取搅拌30 min，离心（4000 r/min），取上清液定容至100 mL，即为WSP。
1. 4. 3 螯合性果胶（CSP）提取 将1.4.2提取WSP后的沉淀用30 mL 0.05 mol/L EDTA（pH 6.5）在80 ℃提取30 min，离心（4000 r/min），取上清液；沉淀溶于30 mL 0.05 mol/L EDTA（pH 6.5）中，80 ℃提取搅拌30 min，离心（4000 r/min），取上清液定容至100 mL，即为CSP。
1. 4. 4 酸溶性果胶（ASP）提取 将上述提取螯合性果胶后的沉淀用30 mL 0.05 mol/L鹽酸在100 ℃提取1 h，离心（4000 r/min），取上清液；将沉淀溶于30 mL 0.05 mol/L盐酸在100 ℃提取1 h，离心（4000 r/min），取上清液定容至100 mL，即为ASP。
1. 4. 5 果胶组分含量测定 果胶组分含量采用Blumenkrantz和Asboehansen（1973）的半乳糖醛酸法进行测定。分别吸取1.0 mL待测液（WSP、CSP、ASP）加入试管中，再加入6 mL 0.0125 mol/L浓硫酸—四硼酸钠溶液，立即置于冰水浴中；振荡后置于沸水浴中5 min，然后放入冰水浴中冷却，再加入0.1 mL 0.15%间苯基苯酚溶液，振荡后在5 min内测定520 nm处吸光值。从标准曲线中查出半乳糖醛酸浓度（μg/mL），计算果胶组分WSP、CSP和ASP的半乳糖醛酸含量。
1. 5 柿果果胶提取
采用超声波辅助酸提法（Sudhakar and Maini，2000；Kratchanova et al.，2004；Nguyěn and Savage，2013）提取柿果果胶。将不同时间脱涩处理的柿果打浆并各自称取50.0 g，加入400 mL pH 1.5盐酸提取液，超声提取25 min（80 ℃、300 W），冷却至0 ℃后，用4层纱布过滤除去滤渣，滤液加入等量96%乙醇并0 ℃低温沉淀1 h，离心（4000 r/min，20 min），得到的沉淀用70%酸性乙醇（0.5%盐酸）洗涤，再次离心，沉淀物用96%乙醇清洗并5000 r/min离心10 min，得到的沉淀置于40 ℃烘箱烘干，称重，即得到柿果果胶粗提物。
1. 6 柿果果胶品质测定
1. 6. 1 果胶半乳糖醛酸含量测定 根据1.4.5半乳糖醛酸法测定果胶中的半乳糖醛酸含量。
1. 6. 2 果胶色泽 将干燥、粉碎后的柿果果胶平铺，用Minolta CR-410色差计测定色差，读取L*（亮度）、a*（由绿到红）、b*（由蓝到黄）。采用Hunter表色系统（Berardini et al.，2005；曹霞敏等，2010），以L*、C*和h°表示柿果果胶的颜色变化，其中C*为彩度，其值越大表明样品颜色越纯；h°为色度角，其值越大表示样品红色减弱，黄色增强。C*和h°的计算公式如下：
1. 6. 3 果胶酯化度 参照QB 2484-2000的方法测定。称取50.0 mg提取到的柿果果胶移入250 mL碘量瓶中，用2.0 mL乙醇润湿，加入100 mL不含CO2的蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌至样品溶解，加入酚酞，用0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液进行滴定，记录所消耗NaOH的体积（V1），即为初滴定度；再加入20 mL 0.5 mol/L氢氧化钠标准溶液，强烈振摇15 min后加入20 mL 0.5 mol/L盐酸溶液，振摇至粉红色消失为止；然后再次加入酚酞，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定至呈微红色。记录消耗NaOH体积（V2），即为皂化滴定度。根据公式计算果胶酯化度：
果胶酯化度（%）=V2/（V1+V2）×100
1. 6. 4 果胶单糖组成分析 称取10.0 mg果胶样品置于5.0 mL具塞刻度试管中，加入1.0 mL 4.0 mol/L三氟乙酸，充N2后封闭试管，于110 ℃烘箱中水解2 h，冷却后打开试管，用N2吹干除去三氟乙酸，水解的果胶液用水定容至50 mL，0.22 μm微膜过滤后备用。
将上述水解后的果胶液样进至ICS-5000离子色谱仪，采用梯度法测定果胶的单糖组成。离子色谱条件：色谱柱CarboPac PA20（3 mm×150 mm）；流动相：水（A）、250 mmol/L氢氧化钠溶液（B）和1.0 mol/L醋酸钠溶液（C）；梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃；进样量100 μL；脉冲安培检测器检测。
根据标准品的相对保留时间对果胶单糖物质进行定性，再根据标准品各组分的峰面积计算果胶单糖相对百分含量。 1. 7 统计分析
采用Excel 2003统计数据并制图，利用SPSS 19.0对试验数据进行差异显著性分析。所有数据为3次重复试验的平均值。
2 结果与分析
2. 1 CO2脱涩对柿果可溶性和不溶性单宁含量的影响
涩柿脱涩即将可溶性单宁转化为不溶性单宁，一般以柿果中可溶性单宁含量2.0 mg/g作为是否脱涩的临界值（Taira et al.，1996）。Matsuo和Ito（1977）将CO2脱涩过程分为诱导期和脱涩期，诱导期是密闭条件下CO2处理过程，脱涩期是撤除CO2后柿果进入自动脱涩过程。由图1可知，随着CO2脱涩处理时间的延长，柿果可溶性单宁含量迅速降低，不溶性单宁含量不断升高，总单宁含量也逐渐升高。柿果不溶性单宁含量由处理1的1.07 mg/g升至处理4的13.28 mg/g；处理1柿果可溶性单宁含量为10.45 mg/g，处理2柿果可溶性单宁含量降至2.00 mg/g，表明经90%～95% CO2处理15 h后室温放置24 h的金瓶柿脱涩完全，可食用；处理3和处理4的柿果可溶性单宁含量分别为1.14和0.81 mg/g。可见大量可溶性单宁的减少主要发生在CO2处理前期，随着CO2脱涩处理时间的延长，可溶性单宁含量下降幅度减小。
2. 2 CO2脱涩对柿果细胞壁果胶组分的影响
图2为柿果所含WSP、CSP和ASP在不同CO2脱涩时间处理下的含量变化情况。随着脱涩处理时间的延长，WSP含量呈先降低后升高的变化趋势；CSP含量则呈先升高后降低的变化趋势，但4个处理柿果CSP含量间无显著差异（P>0.05，下同）；ASP含量也呈先升高后降低的变化趋势，处理3柿果ASP含量最高，為2.20 mg/g。表明无论柿果是否经CO2脱涩处理，果实细胞壁均以CSP和ASP为主。
2. 3 CO2脱涩对柿果果胶提取率的影响
经不同CO2脱涩时间处理后，采用超声波辅助酸提法提取柿果果胶，其果胶提取率如图3所示。CO2脱涩处理时间越长，果实可溶性单宁含量越低，柿果果胶提取率则越高。其中，未经脱涩的柿果果胶提取率最低，为0.68 mg/g，处理2、3、4的果胶提取率分别为1.20、2.57和3.40 mg/g，与未脱涩柿果相比，果胶提取率分别提高了0.77、2.78和4.00倍，4个脱涩处理的柿果果胶提取率间存在显著差异（P<0.05，下同）。
2. 4 CO2脱涩对提取的柿果果胶理化性质的影响
2. 4. 1 果胶色泽变化 从表2可看出，随着柿果脱涩时间的延长，果胶亮度L*逐渐降低，各处理间存在显著差异；果胶彩度C*呈先升高后降低的变化趋势，各处理间的柿果果胶颜色纯度有差异；果胶色度角h°与C*变化趋势相反，h°先降低后升高，即果胶红色先增强后减弱，黄色先减弱后增强。与处理1相比，处理4柿果果胶L*下降了18%， C*降低了7%，色度角h°下降了15%，即与未脱涩柿果果胶色泽相比，90%～95% CO2处理40 h并室温放置48 h的柿果果胶较暗，纯度稍低，样品红色增强、黄色减弱。
2. 4. 2 果胶半乳糖醛酸含量变化 由图4可知，不同CO2脱涩时间处理柿果提取的果胶半乳糖醛酸含量间存在显著差异。柿果CO2脱涩程度越高，果胶半乳糖醛酸含量越高。处理1柿果果胶半乳糖醛酸含量为17.66%，处理4的果胶半乳糖醛酸含量升至27.49%，提高了56%。
2. 4. 3 果胶酯化度变化 采用滴定法测定不同CO2脱涩程度柿果果胶的酯化度，发现其酯化度均大于50.00%，属于高甲氧基果胶（图5）。随着CO2脱涩处理时间的延长，果胶酯化度逐渐降低，但处理1、2、3柿果果胶酯化度之间无显著差异，处理4柿果果胶酯化度显著低于其他3个处理，为68.87%。由此可知，涩柿经过短时间CO2脱涩处理不会影响柿果果胶酯化度，但脱涩完成后长时间放置会显著降低柿果果胶酯化度。
2. 4. 4 果胶单糖组成 在本试验确定的梯度洗脱条件下进行单糖物质分离，得到12种单糖混合标准色谱图（图6）。单糖相对百分含量测定结果如表3所示。对比12种单糖标准物质峰发现，无论柿果是否进行CO2脱涩处理，提取的柿果果胶降解后均含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸6种单糖，但各单糖的相对百分含量则随脱涩时间的不同发生变化，其中阿拉伯糖和木糖相对百分含量均随着脱涩时间的延长而逐渐降低，半乳糖醛酸相对百分含量则逐渐升高。未脱涩涩柿（处理1）果胶单糖以阿拉伯糖、半乳糖和木糖为主，进行CO2脱涩处理的柿果（处理2和处理3）果胶单糖以半乳糖和半乳糖醛酸为主，进行CO2脱涩处理后长时间放置软化的柿果（处理4）果胶单糖以葡萄糖、半乳糖醛酸和半乳糖为主。
3 讨论
3. 1 CO2脱涩处理促使柿果可溶性单宁向不溶性单宁转化
目前，关于CO2处理可使柿果脱涩的机理研究主要分为两个方面：一是CO2处理可以提高柿果乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的表达水平，进而促进乙醛合成，乙醛与可溶性单宁原花青素A环的C-6或C-8结合或凝结成不溶性单宁（Min et al.，2012；Besada et al.，2013）；二是可溶性单宁与某些细胞内含物结合形成复合体，使得柿果可溶性单宁含量降低而失去涩味（Taira et al.，1997；李宝等，2010）。本研究发现CO2脱涩过程中可溶性单宁的减少与不溶性单宁的增多并非同步等量进行，前者主要发生在脱涩诱导过程，后者主要发生在脱涩后期，CO2脱涩原理不是简单的可溶性单宁与复合体结合生成不溶性单宁，而主要是厌氧环境生成的乙醛诱发可溶性单宁聚合成中间复合物再转化为不溶性单宁，与Min等（2012，2014）的研究结果一致。
3. 2 CO2脱涩引起柿果细胞壁果胶构成的变化 本研究发现，随着柿果脱涩程度的提高，细胞壁WSP含量先降低后升高，原果胶即CSP和ASP含量则先升高后降低。柿果进行CO2处理时，与果实软化相关的酶活性受到抑制，一是因为CO2是乙烯抑制剂，高浓度CO2具有抑制乙烯生成的作用，难以诱导果实的软化（Itamura et al.，1995；Serek et al.，2006）；二是因为柿果中含有大量可溶性单宁，可与果胶降解相关酶缩合而抑制其活性（Field and Lettinga，1992；Asgar et al.，2003）。此时细胞壁无氧呼吸致细胞质膜透性增加而释放出Ca2+、Mg2+、Fe2+等阳离子，CSP为离子结合型果胶，因此WSP吸附陽离子产生难溶于水的CSP，从而稳定细胞壁结构（Chang et al.，1999；陆胜民等，2003）。但只有一部分WSP吸附阳离子，还有大量的WSP与可溶性单宁结合生成果胶—单宁复合体，可能是造成WSP含量明显下降的主要原因（Guan et al.，2015）。因WSP的减少和原果胶产物的增多，柿果CO2处理脱涩过程中能够保持较好硬度和脆度，即延迟柿果软化。
Yin等（2012）研究表明，CO2脱涩处理可有效维持柿果实硬度，但脱涩完成后果实快速软化。这是由于高浓度CO2处理可抑制乙烯生成，但一旦撤去CO2，柿果快速释放大量乙烯并在常温放置1～5 d后达到高峰，乙烯高峰1 d后柿果快速软化（Harima et al.，2003）。本研究测定CO2处理24 h并室温放置24 h后的金瓶柿原果胶含量，发现其达到高峰值。随着CO2处理和室温放置时间的延长，原果胶降低而WSP急剧增加，可能是由于高分子量、高甲氧基的果胶转变为低分子量、可溶于水的果胶，同时与果胶降解相关的酶因可溶性单宁减少而酶活性增强，导致果胶质受到各种酶作用，使得果胶质增容或解聚（Costa et al.，2012；齐秀东等，2015），完全脱涩的柿果快速软化。
3. 3 CO2脱涩利于柿果果胶的提取
本研究在提取柿果果胶时发现，涩柿果肉在超声波辅助盐酸液提取时易聚集成团，果实可溶性单宁含量越高，果肉聚集程度越高，且聚集物漂浮于提取液表面，即使对其进行搅拌，果肉仍会再次快速聚集在一起。这可能是因为可溶性单宁与蛋白质、果胶、细胞碎片等絮凝成团，阻止了可溶性果胶的提取。随着柿果脱涩程度的提高，可溶性单宁含量下降，果肉逐渐散开并沉于提取液底部，可溶性果胶被释放，果胶提取率显著提高。柿果完全脱涩后，可溶性单宁含量的下降幅度较小，但果胶提取量却显著提高，可能是因为柿果软化时细胞壁结构被破坏，释放出的原果胶在盐酸作用下被浸出。
3. 4 CO2脱涩对柿果果胶理化性质的影响
CO2脱涩过程中细胞壁果胶成分的变化导致提取的柿果果胶性质随之发生改变，如半乳糖醛酸含量、酯化度、单糖组成等。
高浓度的CO2和1-MCP一样具有抑制乙烯生成的作用，抑制柿果软化相关酶活性，从而延缓柿果后熟（张雪丹等，2014）。但在柿果实软化过程中，催化软化的关键酶果胶甲酯酶被激活，并与多聚半乳糖醛酸酶协同作用，果胶甲酯酶切去细胞壁多聚半乳糖醛酸分子C6位置的甲氧基基团，多聚半乳糖醛酸酶解聚脱甲酯化的多聚半乳糖醛酸间的α-（1→4）糖苷键（Luo，2007），导致半乳糖醛酸单糖的降解和多聚糖醛酸的解聚，从而引起柿果果胶半乳糖醛酸含量升高、酯化度降低。因此，果胶酯化度在柿果CO2脱涩处理短时间内未出现显著变化，但CO2处理后软化过程中柿果果胶酯化度显著下降。
关于柿果果胶单糖成分的研究主要集中在水溶性果胶部分，目前已检测到的单糖组分包括阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和半乳糖醛酸（Tsuchida et al.，2003；Asgar et al.，2004）。研究表明，WSP与柿果硬度呈显著负相关（Tsuchida et al.，2003；Luo，2007），随着果实的软化，柿果WSP中阿拉伯糖和半乳糖含量降低；在柿果日晒脱涩过程中，阿拉伯糖和半乳糖含量显著降低，鼠李糖含量逐渐升高（Tsuchida et al.，2003；Asgar et al.，2004）。本研究对不同CO2脱涩处理的柿果总果胶的单糖组成进行分析，均检测出鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸6种单糖，但其组成变化的调控机理还需进一步研究阐明。
4 结论
CO2脱涩处理可显著提高柿果果胶提取率，并影响提取果胶的理化性质，因此脱涩可作为制备柿果果胶的前处理工序，以90%～95% CO2处理柿果40 h后室温放置48 h的脱涩方式提取得到的果胶品质更佳。
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（責任编辑 罗 丽）
关键词： 柿；CO2脱涩；果胶组成；理化性质；可溶性单宁
中图分类号： S665.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）03-0499-08
0 引言
【研究意义】果胶是植物细胞壁特有的胶体性多糖物質，包括原果胶、果胶和果胶酸，主要对细胞组织起黏合和软化作用。果胶具有良好的凝胶、增稠、稳定和乳化等作用，已在食品、医药、化妆品、纺织等领域广泛应用（王恒禹等，2013）。柿果含有丰富的果胶物质且品质良好（陈佩等，2012），但在果胶提取过程中，涩柿果肉中大量的可溶性单宁与可溶性果胶结合，进而抑制果胶的提取。因此，研究涩柿脱涩过程即可溶性单宁转化为不溶性单宁过程中柿果细胞壁果胶组分、提取率及理化性质的变化，对提高柿果果胶的开发程度和应用价值具有重要意义。【前人研究进展】高浓度CO2处理是一种广泛应用于生产的涩柿脱涩方法（Arnal and Del Río，2003；Besada et al.，2010），其对柿果细胞壁果胶的影响表现在两方面：一是造成细胞壁和原生质膜机械性损伤（Salvador et al.，2007；Novillo et al.，2014），将果胶、单宁等物质释放出来，水溶性果胶与可溶性单宁、阳离子等结合生成难溶于水的果胶组分（Taira et al.，1997；Chang et al.，1999）；二是降低可溶性单宁含量，可增强果胶降解相关酶活性（Field and Lettinga，1992；Asgar et al.，2003；Khademi et al.，2014），促使原果胶降解为可溶性果胶，加速柿果软化（Xu et al.，2004；郭孝辉等，2006；Yakushiji and Nakatsuka，2007）。果胶提取是一个不溶性果胶转化为可溶性果胶和可溶性果胶向液相转移的过程（徐溪，2010）。目前已有利用柿果提取果胶的工艺研究，但多以柿果皮为原料，如利用盐析法（陈栓虎和高全昌，1995）、纤维素酶法（张娜等，2011）、超滤法（王继芝，2013）等，近年来也有筛选具有单宁耐受性的原果胶降解酶菌株的研究（Liu et al.，2012；Taskin，2013），但这些方法能否实现涩柿果实规模化提取果胶还有待进一步研究。【本研究切入点】目前国内外多集中于研究柿果CO2脱涩机理及其生理变化，尚未见有关脱涩过程中细胞壁不同果胶组分及果胶提取率和提取的果胶理化性质变化的研究报道。【拟解决的关键问题】研究不同程度CO2脱涩对柿果细胞壁果胶及果胶提取率和理化性质的影响，旨在为涩柿果胶的高效提取和应用提供技术支持。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试柿果品种为金瓶柿，采自山东省临沂市高桥镇凤凰官庄柿园。采收后3 h内运至山东省果树研究所并立即置于5.0～8.0 ℃冷库中预冷12 h，挑选8～9成熟、大小均匀、色泽金黄的柿果，用10～15 kg聚乙烯保鲜袋包装扎口后，置于温度-1.0～2.0 ℃、湿度80%～90%的冷库中贮藏备用。
甲醇、乙醇、丙酮购自国药集团化学试剂有限公司，均为国产分析纯；98%硫酸、37%盐酸购自天津市永大化学试剂有限公司；福林酚购自北京索莱宝科技有限公司；碳酸钠、四硼酸钠、氢氧化钠等试剂购自天津市凯通化学试剂有限公司。主要仪器设备：ML-204电子天平[梅特勒—托利多国际贸易（上海）有限公司]，UV-2100紫外分光光度计（瑞典Amersham Biosioscience公司），KQ300超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），MS300磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司），5810R高速离心机[艾本德（上海）国际贸易有限公司]，0.22 μm微孔滤膜和膜过滤器（上海兴亚净化材料厂），CR-410色差计（日本Minolta株式会社），ICS-5000离子色谱仪（美国Dionex股份有限公司）。
1. 2 试验设计
将贮藏的柿果平均分成4份进行不同时间的CO2脱涩处理。处理1：未脱涩；处理2：将柿果置于浓度为90%～95% CO2密闭空间内室温脱涩15 h，撤去CO2处理后再室温放置24 h；处理3：将柿果置于90%～95%CO2密闭空间内室温脱涩24 h，撤去CO2处理后再室温放置24 h；处理4：将柿果置于90%～95% CO2密闭空间内室温脱涩40 h，撤去CO2处理后再室温放置48 h。4个不同脱涩程度的柿果分别进行单宁、果胶的测定和果胶提取，每处理重复3次。 1. 3 柿果可溶性和不溶性单宁含量测定
参照Oshida等（1996）的方法提取可溶性和不溶性单宁，采用福林酚法测定单宁含量。单宁含量以没食子酸计。
1. 4 柿果细胞壁果胶组分测定
参照Taira等（1997）和Luo（2007）的方法进行测定。
1. 4. 1 酒精不溶性物质（AIR）制备 取柿果果肉10.0 g，用50 mL 95%乙醇煮沸30 min，冷却后5000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀用30 mL 80%乙醇清洗煮沸30 min，5000 r/min离心15 min，弃上清液，重复操作两次；沉淀再分别用100%乙醇和100%丙酮清洗，洗涤过程中的残渣轻轻捣碎使之不成团，过滤后40 ℃干燥过夜，然后真空包装，即为AIR。
1. 4. 2 水溶性果胶（WSP）提取 称取0.5 g AIR溶于30 mL去离子水中，20 ℃提取过夜，离心（4000 r/min），取上清液；沉淀再次溶于30 mL去离子水中，20 ℃提取搅拌30 min，离心（4000 r/min），取上清液定容至100 mL，即为WSP。
1. 4. 3 螯合性果胶（CSP）提取 将1.4.2提取WSP后的沉淀用30 mL 0.05 mol/L EDTA（pH 6.5）在80 ℃提取30 min，离心（4000 r/min），取上清液；沉淀溶于30 mL 0.05 mol/L EDTA（pH 6.5）中，80 ℃提取搅拌30 min，离心（4000 r/min），取上清液定容至100 mL，即为CSP。
1. 4. 4 酸溶性果胶（ASP）提取 将上述提取螯合性果胶后的沉淀用30 mL 0.05 mol/L鹽酸在100 ℃提取1 h，离心（4000 r/min），取上清液；将沉淀溶于30 mL 0.05 mol/L盐酸在100 ℃提取1 h，离心（4000 r/min），取上清液定容至100 mL，即为ASP。
1. 4. 5 果胶组分含量测定 果胶组分含量采用Blumenkrantz和Asboehansen（1973）的半乳糖醛酸法进行测定。分别吸取1.0 mL待测液（WSP、CSP、ASP）加入试管中，再加入6 mL 0.0125 mol/L浓硫酸—四硼酸钠溶液，立即置于冰水浴中；振荡后置于沸水浴中5 min，然后放入冰水浴中冷却，再加入0.1 mL 0.15%间苯基苯酚溶液，振荡后在5 min内测定520 nm处吸光值。从标准曲线中查出半乳糖醛酸浓度（μg/mL），计算果胶组分WSP、CSP和ASP的半乳糖醛酸含量。
1. 5 柿果果胶提取
采用超声波辅助酸提法（Sudhakar and Maini，2000；Kratchanova et al.，2004；Nguyěn and Savage，2013）提取柿果果胶。将不同时间脱涩处理的柿果打浆并各自称取50.0 g，加入400 mL pH 1.5盐酸提取液，超声提取25 min（80 ℃、300 W），冷却至0 ℃后，用4层纱布过滤除去滤渣，滤液加入等量96%乙醇并0 ℃低温沉淀1 h，离心（4000 r/min，20 min），得到的沉淀用70%酸性乙醇（0.5%盐酸）洗涤，再次离心，沉淀物用96%乙醇清洗并5000 r/min离心10 min，得到的沉淀置于40 ℃烘箱烘干，称重，即得到柿果果胶粗提物。
1. 6 柿果果胶品质测定
1. 6. 1 果胶半乳糖醛酸含量测定 根据1.4.5半乳糖醛酸法测定果胶中的半乳糖醛酸含量。
1. 6. 2 果胶色泽 将干燥、粉碎后的柿果果胶平铺，用Minolta CR-410色差计测定色差，读取L*（亮度）、a*（由绿到红）、b*（由蓝到黄）。采用Hunter表色系统（Berardini et al.，2005；曹霞敏等，2010），以L*、C*和h°表示柿果果胶的颜色变化，其中C*为彩度，其值越大表明样品颜色越纯；h°为色度角，其值越大表示样品红色减弱，黄色增强。C*和h°的计算公式如下：
1. 6. 3 果胶酯化度 参照QB 2484-2000的方法测定。称取50.0 mg提取到的柿果果胶移入250 mL碘量瓶中，用2.0 mL乙醇润湿，加入100 mL不含CO2的蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌至样品溶解，加入酚酞，用0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液进行滴定，记录所消耗NaOH的体积（V1），即为初滴定度；再加入20 mL 0.5 mol/L氢氧化钠标准溶液，强烈振摇15 min后加入20 mL 0.5 mol/L盐酸溶液，振摇至粉红色消失为止；然后再次加入酚酞，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定至呈微红色。记录消耗NaOH体积（V2），即为皂化滴定度。根据公式计算果胶酯化度：
果胶酯化度（%）=V2/（V1+V2）×100
1. 6. 4 果胶单糖组成分析 称取10.0 mg果胶样品置于5.0 mL具塞刻度试管中，加入1.0 mL 4.0 mol/L三氟乙酸，充N2后封闭试管，于110 ℃烘箱中水解2 h，冷却后打开试管，用N2吹干除去三氟乙酸，水解的果胶液用水定容至50 mL，0.22 μm微膜过滤后备用。
将上述水解后的果胶液样进至ICS-5000离子色谱仪，采用梯度法测定果胶的单糖组成。离子色谱条件：色谱柱CarboPac PA20（3 mm×150 mm）；流动相：水（A）、250 mmol/L氢氧化钠溶液（B）和1.0 mol/L醋酸钠溶液（C）；梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃；进样量100 μL；脉冲安培检测器检测。
根据标准品的相对保留时间对果胶单糖物质进行定性，再根据标准品各组分的峰面积计算果胶单糖相对百分含量。 1. 7 统计分析
采用Excel 2003统计数据并制图，利用SPSS 19.0对试验数据进行差异显著性分析。所有数据为3次重复试验的平均值。
2 结果与分析
2. 1 CO2脱涩对柿果可溶性和不溶性单宁含量的影响
涩柿脱涩即将可溶性单宁转化为不溶性单宁，一般以柿果中可溶性单宁含量2.0 mg/g作为是否脱涩的临界值（Taira et al.，1996）。Matsuo和Ito（1977）将CO2脱涩过程分为诱导期和脱涩期，诱导期是密闭条件下CO2处理过程，脱涩期是撤除CO2后柿果进入自动脱涩过程。由图1可知，随着CO2脱涩处理时间的延长，柿果可溶性单宁含量迅速降低，不溶性单宁含量不断升高，总单宁含量也逐渐升高。柿果不溶性单宁含量由处理1的1.07 mg/g升至处理4的13.28 mg/g；处理1柿果可溶性单宁含量为10.45 mg/g，处理2柿果可溶性单宁含量降至2.00 mg/g，表明经90%～95% CO2处理15 h后室温放置24 h的金瓶柿脱涩完全，可食用；处理3和处理4的柿果可溶性单宁含量分别为1.14和0.81 mg/g。可见大量可溶性单宁的减少主要发生在CO2处理前期，随着CO2脱涩处理时间的延长，可溶性单宁含量下降幅度减小。
2. 2 CO2脱涩对柿果细胞壁果胶组分的影响
图2为柿果所含WSP、CSP和ASP在不同CO2脱涩时间处理下的含量变化情况。随着脱涩处理时间的延长，WSP含量呈先降低后升高的变化趋势；CSP含量则呈先升高后降低的变化趋势，但4个处理柿果CSP含量间无显著差异（P>0.05，下同）；ASP含量也呈先升高后降低的变化趋势，处理3柿果ASP含量最高，為2.20 mg/g。表明无论柿果是否经CO2脱涩处理，果实细胞壁均以CSP和ASP为主。
2. 3 CO2脱涩对柿果果胶提取率的影响
经不同CO2脱涩时间处理后，采用超声波辅助酸提法提取柿果果胶，其果胶提取率如图3所示。CO2脱涩处理时间越长，果实可溶性单宁含量越低，柿果果胶提取率则越高。其中，未经脱涩的柿果果胶提取率最低，为0.68 mg/g，处理2、3、4的果胶提取率分别为1.20、2.57和3.40 mg/g，与未脱涩柿果相比，果胶提取率分别提高了0.77、2.78和4.00倍，4个脱涩处理的柿果果胶提取率间存在显著差异（P<0.05，下同）。
2. 4 CO2脱涩对提取的柿果果胶理化性质的影响
2. 4. 1 果胶色泽变化 从表2可看出，随着柿果脱涩时间的延长，果胶亮度L*逐渐降低，各处理间存在显著差异；果胶彩度C*呈先升高后降低的变化趋势，各处理间的柿果果胶颜色纯度有差异；果胶色度角h°与C*变化趋势相反，h°先降低后升高，即果胶红色先增强后减弱，黄色先减弱后增强。与处理1相比，处理4柿果果胶L*下降了18%， C*降低了7%，色度角h°下降了15%，即与未脱涩柿果果胶色泽相比，90%～95% CO2处理40 h并室温放置48 h的柿果果胶较暗，纯度稍低，样品红色增强、黄色减弱。
2. 4. 2 果胶半乳糖醛酸含量变化 由图4可知，不同CO2脱涩时间处理柿果提取的果胶半乳糖醛酸含量间存在显著差异。柿果CO2脱涩程度越高，果胶半乳糖醛酸含量越高。处理1柿果果胶半乳糖醛酸含量为17.66%，处理4的果胶半乳糖醛酸含量升至27.49%，提高了56%。
2. 4. 3 果胶酯化度变化 采用滴定法测定不同CO2脱涩程度柿果果胶的酯化度，发现其酯化度均大于50.00%，属于高甲氧基果胶（图5）。随着CO2脱涩处理时间的延长，果胶酯化度逐渐降低，但处理1、2、3柿果果胶酯化度之间无显著差异，处理4柿果果胶酯化度显著低于其他3个处理，为68.87%。由此可知，涩柿经过短时间CO2脱涩处理不会影响柿果果胶酯化度，但脱涩完成后长时间放置会显著降低柿果果胶酯化度。
2. 4. 4 果胶单糖组成 在本试验确定的梯度洗脱条件下进行单糖物质分离，得到12种单糖混合标准色谱图（图6）。单糖相对百分含量测定结果如表3所示。对比12种单糖标准物质峰发现，无论柿果是否进行CO2脱涩处理，提取的柿果果胶降解后均含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸6种单糖，但各单糖的相对百分含量则随脱涩时间的不同发生变化，其中阿拉伯糖和木糖相对百分含量均随着脱涩时间的延长而逐渐降低，半乳糖醛酸相对百分含量则逐渐升高。未脱涩涩柿（处理1）果胶单糖以阿拉伯糖、半乳糖和木糖为主，进行CO2脱涩处理的柿果（处理2和处理3）果胶单糖以半乳糖和半乳糖醛酸为主，进行CO2脱涩处理后长时间放置软化的柿果（处理4）果胶单糖以葡萄糖、半乳糖醛酸和半乳糖为主。
3 讨论
3. 1 CO2脱涩处理促使柿果可溶性单宁向不溶性单宁转化
目前，关于CO2处理可使柿果脱涩的机理研究主要分为两个方面：一是CO2处理可以提高柿果乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的表达水平，进而促进乙醛合成，乙醛与可溶性单宁原花青素A环的C-6或C-8结合或凝结成不溶性单宁（Min et al.，2012；Besada et al.，2013）；二是可溶性单宁与某些细胞内含物结合形成复合体，使得柿果可溶性单宁含量降低而失去涩味（Taira et al.，1997；李宝等，2010）。本研究发现CO2脱涩过程中可溶性单宁的减少与不溶性单宁的增多并非同步等量进行，前者主要发生在脱涩诱导过程，后者主要发生在脱涩后期，CO2脱涩原理不是简单的可溶性单宁与复合体结合生成不溶性单宁，而主要是厌氧环境生成的乙醛诱发可溶性单宁聚合成中间复合物再转化为不溶性单宁，与Min等（2012，2014）的研究结果一致。
3. 2 CO2脱涩引起柿果细胞壁果胶构成的变化 本研究发现，随着柿果脱涩程度的提高，细胞壁WSP含量先降低后升高，原果胶即CSP和ASP含量则先升高后降低。柿果进行CO2处理时，与果实软化相关的酶活性受到抑制，一是因为CO2是乙烯抑制剂，高浓度CO2具有抑制乙烯生成的作用，难以诱导果实的软化（Itamura et al.，1995；Serek et al.，2006）；二是因为柿果中含有大量可溶性单宁，可与果胶降解相关酶缩合而抑制其活性（Field and Lettinga，1992；Asgar et al.，2003）。此时细胞壁无氧呼吸致细胞质膜透性增加而释放出Ca2+、Mg2+、Fe2+等阳离子，CSP为离子结合型果胶，因此WSP吸附陽离子产生难溶于水的CSP，从而稳定细胞壁结构（Chang et al.，1999；陆胜民等，2003）。但只有一部分WSP吸附阳离子，还有大量的WSP与可溶性单宁结合生成果胶—单宁复合体，可能是造成WSP含量明显下降的主要原因（Guan et al.，2015）。因WSP的减少和原果胶产物的增多，柿果CO2处理脱涩过程中能够保持较好硬度和脆度，即延迟柿果软化。
Yin等（2012）研究表明，CO2脱涩处理可有效维持柿果实硬度，但脱涩完成后果实快速软化。这是由于高浓度CO2处理可抑制乙烯生成，但一旦撤去CO2，柿果快速释放大量乙烯并在常温放置1～5 d后达到高峰，乙烯高峰1 d后柿果快速软化（Harima et al.，2003）。本研究测定CO2处理24 h并室温放置24 h后的金瓶柿原果胶含量，发现其达到高峰值。随着CO2处理和室温放置时间的延长，原果胶降低而WSP急剧增加，可能是由于高分子量、高甲氧基的果胶转变为低分子量、可溶于水的果胶，同时与果胶降解相关的酶因可溶性单宁减少而酶活性增强，导致果胶质受到各种酶作用，使得果胶质增容或解聚（Costa et al.，2012；齐秀东等，2015），完全脱涩的柿果快速软化。
3. 3 CO2脱涩利于柿果果胶的提取
本研究在提取柿果果胶时发现，涩柿果肉在超声波辅助盐酸液提取时易聚集成团，果实可溶性单宁含量越高，果肉聚集程度越高，且聚集物漂浮于提取液表面，即使对其进行搅拌，果肉仍会再次快速聚集在一起。这可能是因为可溶性单宁与蛋白质、果胶、细胞碎片等絮凝成团，阻止了可溶性果胶的提取。随着柿果脱涩程度的提高，可溶性单宁含量下降，果肉逐渐散开并沉于提取液底部，可溶性果胶被释放，果胶提取率显著提高。柿果完全脱涩后，可溶性单宁含量的下降幅度较小，但果胶提取量却显著提高，可能是因为柿果软化时细胞壁结构被破坏，释放出的原果胶在盐酸作用下被浸出。
3. 4 CO2脱涩对柿果果胶理化性质的影响
CO2脱涩过程中细胞壁果胶成分的变化导致提取的柿果果胶性质随之发生改变，如半乳糖醛酸含量、酯化度、单糖组成等。
高浓度的CO2和1-MCP一样具有抑制乙烯生成的作用，抑制柿果软化相关酶活性，从而延缓柿果后熟（张雪丹等，2014）。但在柿果实软化过程中，催化软化的关键酶果胶甲酯酶被激活，并与多聚半乳糖醛酸酶协同作用，果胶甲酯酶切去细胞壁多聚半乳糖醛酸分子C6位置的甲氧基基团，多聚半乳糖醛酸酶解聚脱甲酯化的多聚半乳糖醛酸间的α-（1→4）糖苷键（Luo，2007），导致半乳糖醛酸单糖的降解和多聚糖醛酸的解聚，从而引起柿果果胶半乳糖醛酸含量升高、酯化度降低。因此，果胶酯化度在柿果CO2脱涩处理短时间内未出现显著变化，但CO2处理后软化过程中柿果果胶酯化度显著下降。
关于柿果果胶单糖成分的研究主要集中在水溶性果胶部分，目前已检测到的单糖组分包括阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和半乳糖醛酸（Tsuchida et al.，2003；Asgar et al.，2004）。研究表明，WSP与柿果硬度呈显著负相关（Tsuchida et al.，2003；Luo，2007），随着果实的软化，柿果WSP中阿拉伯糖和半乳糖含量降低；在柿果日晒脱涩过程中，阿拉伯糖和半乳糖含量显著降低，鼠李糖含量逐渐升高（Tsuchida et al.，2003；Asgar et al.，2004）。本研究对不同CO2脱涩处理的柿果总果胶的单糖组成进行分析，均检测出鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸6种单糖，但其组成变化的调控机理还需进一步研究阐明。
4 结论
CO2脱涩处理可显著提高柿果果胶提取率，并影响提取果胶的理化性质，因此脱涩可作为制备柿果果胶的前处理工序，以90%～95% CO2处理柿果40 h后室温放置48 h的脱涩方式提取得到的果胶品质更佳。
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（責任编辑 罗 丽）