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组织培养是从20世纪30年代初发展起来的技术，它是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体培养在人工配制的培养基上，在适宜的光照、温度等条件下培养，诱导产生愈伤组织，长成完整植株。具有环境条件可控，实验误差小；生长快、周期短，可重复性强；可连续运行、周年试验生产的独特优越性。组织培养技术要求在无菌环境中操作，这对组织培养实验室的建设，实验操作中培养基的配制、外植体的取材、消毒、接种、培养等各个环节提出了严格的要求。如何有效消毒、预防污染成为了关键。
组织培养污染的来源
在组织培养过程中，造成污染的原因很多。主要有两个原因，灭菌消毒不彻底或者操作不正确引起污染。在前期准备阶段：培养基灭菌不彻底、器皿的灭菌不完全、外植体的选择不当与消毒不彻底；无菌操作阶段：无菌操作室灭菌、超净工作台有问题；操作不规范、工具的消毒不彻底等；培养阶段，由于培养环境不清洁等。在组织培养过程中，具有非常适合微生物生长的温度、湿度、营养、pH值等，一旦出现污染菌，在外植体以及周围培养基的部位迅速滋生，通过繁殖竞争营养、侵蚀植物材料、分泌有毒代谢产物等途径使植物材料培养失败，造成污染最常见是细菌、霉菌、酵母菌等[1]。
组织培养室或无菌操作室的消毒
组培实验室的无菌状态是组织培养成功的先决条件。实验室是专门预备的，使用之前必须彻底的消毒，通常采取酚熏法：首先房子要密封，用甲醛和高锰酸钾熏蒸无菌室和培养室，甲醛用量4～6 mL，高锰酸钾3～6 mg，1 年中熏蒸1～2 次，喷雾墙壁、角落、地面喷雾要均匀，不遗漏。而且接种室每次接种前也必须进行消毒。超净工作台或者是安全柜是组织培养实验的主要设备。实验操作前，用酒精棉球将工作台仔细擦拭两遍，尤其是洁净工作台的接口处一定要反复擦拭，将台内紫外灯打开15～30 min，之后关掉紫外灯并打开超净工作台风机，20 min后即可进行实验操作。用70%酒精在操净工作台内喷雾使空气中的细菌和真菌孢子沉降，70%的酒精湿性消毒溶液擦洗超净工作台面，镊子，剪子；在植物组培操作过程中，超净工作台的风机要始终打开，低风速、均匀的通过工作区时，形成无尘无菌的工作环境[2]。
接种工作者自身的灭菌与消毒
接种工作时的工作服、帽子、口罩和拖鞋应是无菌的，否则要经过紫外线照射25 min以上才能达到无菌的效果。从超净工作台吹出的洁净气流不宜过大，形成无尘无菌的工作环境。实验前，把手掌和手臂一起洗干净，在工作台内用70%～75%酒精擦拭。
培养基配制中易出现的问题及
解决方法
在培养基配制过程中，如果pH不准，需要校准pH，否则会对培养基产生影响，容易滋生细菌。在灭菌过程中一些重要的营养成分、激素和抗生素等会随着高温而分解而失效，如IAA、ZT、ABA等，不能同培养基一起高压灭菌，而需要单独进行过滤灭菌。培养基在使用之前需要高压蒸汽灭菌，121 ℃，保证灭菌时间20 min，可完全灭杀菌微生物、芽孢和孢子，然后将灭过菌的培养基放在组培室或相对无菌的环境中，冷却后待用。一般情况下未接种的培养基放置不能超过5 天，在这期间，如果发现培养基有污染，应丢弃，并及时分析确定污染源，有针对性地加以改进，防止二次污染[2]。
在一些需要大量接种的实验中，由于分批分期操作而持续时间较长。可以将培养基密封好，在冰箱中保鲜，使营养成分不丢失。如果在接种前培养基出现大量污染现象，一般有两种情况：菌类存在于培养基表面是真菌时，可能是因密封不严或环境不洁净引起，菌类种群密度过大所致。若菌类存在于培养基内部，使用污染的贮藏母液，培养瓶不洁净，灭菌不彻底等引起。防治的方法是：保持环境洁净，杜绝使用污染的母液。
接种污染的防治[4]
接种器械和器皿的灭菌
接种器械包括解剖剪、解剖刀、镊子，接种器皿包括接种盘、培养皿等。操作过程中，这些物品直接与外植体接触，必须经过严格灭菌才能使用。灭菌方法湿热灭菌法为：用牛皮纸将接种器械和器皿包好，放在高压灭菌锅中，121 ℃灭菌20 min，然后放在干燥箱内进行干燥。干燥后放在超净工作台上待用。使用前需要火焰灭菌，先用酒精棉球将接种器械从尖端到末端擦拭，酒精挥净后在酒精灯外焰灼烧，待冷却之后备用。在接种过程中，每用一次接种器械都要灭菌。
外植体的获取
外植体的获取通常在晴天，应避免在连续阴雨的情况下取材，因为在植物茎叶表面容易滋生大量的微生物，一些菌丝体甚至侵入表皮内的薄壁组织，不能被一般的表面消毒方法所清除，材料被带入组织培养过程中易引起内生菌的污染。因此，必须选择合适的外植体（如成熟的种子、健壮植株等），以污染少、易启动、易培养、分化率高为原则。迄今为止，组织培养获得的成功，几乎包括了植物体的各个部位，胚、茎尖、成熟种子培育成无菌苗，然后采用无菌芽苗的胚轴、胚根、子叶等为材料，也可减少污染。选择不易污染且易表达全能性的外植体，是成功建立组织培养体系的主要因素之一。
外植体消毒与接种
外植体灭菌方法有表面灭菌和深层灭菌。如以茎尖、茎段和叶片等为较嫩的外植体材料时，常用表面灭菌方法：先用自来水冲洗数分钟，再浸泡到70%的酒精中，用无菌水冲洗2～3 次；再用表面消毒剂如0.1%～0.5%氯化汞或1%～2%（体积/重量）溴水或2%～10%次氯酸钠浸泡。若材料表面不光滑，可以在灭菌液中加入1～2 滴表面活性剂，如吐温80或吐温20，达到更好的消毒效果。消毒后用无菌水充分冲洗3～4 次后，用无菌虑纸吸干，在无菌条件下用解剖刀切取所需大小的茎尖、茎段，将切割好的外植体置于培养基表面，包上封口膜，放到培养架上进行培养。一般的灭菌材料灭菌时间的长短以及灭菌剂浓度的高低以不同外植体而定，时间过长浓度过高有可能造成植物体伤害，过低或者过短达不到抑菌的效果 。
被菌污染的组培苗和组培瓶的处理
即使操作很认真，有时仍然会出现污染现象。造成污染的病原主要分为细菌和真菌两大类。真菌性污染主要指霉菌引起的污染。真菌污染主要来源于环境，细菌污染主要来源于接种材料及工具。组培瓶内组培苗的污染多在接种后2～3 天开始出现，真菌污染一般在接种后3～5 天后出现。培养材料附近出现粘液状和泡沫状，或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。为达到最佳消毒效果，对于材料内部带菌的组织，有时还需在培养基中加入适量抗生素。污染的组织要及时的处理、高压灭菌，防止污染扩散。
【参考文献】
[1] 邵龙珠，赵淑君，王淑荣，刘金华.植物组织培养中的常见问题与解决技术措施[J].林业勘查设计，2012 （1）：49-51.
[2] 彭立群，田子珩，张俊琦.植物组培中污染发生原因及防治技术研究进展[J].广东林业科技，2012，28 （1）：82-86.
[3] 胡凯，张立军，白雪梅.植物组织培养污染原因分析及外植体的消毒[J].安徽农业科学，2007， 35（3）： 680- 681.
[4] 李洪波.植物组织培养操作技术[J].中国花卉盆景，2002（1）：30-31.
[5] 叶添谋.植物组织培养过程中的常见技术难题研究进展[J].韶关学院学报，2010，31（3）：84-90.
组织培养污染的来源
在组织培养过程中，造成污染的原因很多。主要有两个原因，灭菌消毒不彻底或者操作不正确引起污染。在前期准备阶段：培养基灭菌不彻底、器皿的灭菌不完全、外植体的选择不当与消毒不彻底；无菌操作阶段：无菌操作室灭菌、超净工作台有问题；操作不规范、工具的消毒不彻底等；培养阶段，由于培养环境不清洁等。在组织培养过程中，具有非常适合微生物生长的温度、湿度、营养、pH值等，一旦出现污染菌，在外植体以及周围培养基的部位迅速滋生，通过繁殖竞争营养、侵蚀植物材料、分泌有毒代谢产物等途径使植物材料培养失败，造成污染最常见是细菌、霉菌、酵母菌等[1]。
组织培养室或无菌操作室的消毒
组培实验室的无菌状态是组织培养成功的先决条件。实验室是专门预备的，使用之前必须彻底的消毒，通常采取酚熏法：首先房子要密封，用甲醛和高锰酸钾熏蒸无菌室和培养室，甲醛用量4～6 mL，高锰酸钾3～6 mg，1 年中熏蒸1～2 次，喷雾墙壁、角落、地面喷雾要均匀，不遗漏。而且接种室每次接种前也必须进行消毒。超净工作台或者是安全柜是组织培养实验的主要设备。实验操作前，用酒精棉球将工作台仔细擦拭两遍，尤其是洁净工作台的接口处一定要反复擦拭，将台内紫外灯打开15～30 min，之后关掉紫外灯并打开超净工作台风机，20 min后即可进行实验操作。用70%酒精在操净工作台内喷雾使空气中的细菌和真菌孢子沉降，70%的酒精湿性消毒溶液擦洗超净工作台面，镊子，剪子；在植物组培操作过程中，超净工作台的风机要始终打开，低风速、均匀的通过工作区时，形成无尘无菌的工作环境[2]。
接种工作者自身的灭菌与消毒
接种工作时的工作服、帽子、口罩和拖鞋应是无菌的，否则要经过紫外线照射25 min以上才能达到无菌的效果。从超净工作台吹出的洁净气流不宜过大，形成无尘无菌的工作环境。实验前，把手掌和手臂一起洗干净，在工作台内用70%～75%酒精擦拭。
培养基配制中易出现的问题及
解决方法
在培养基配制过程中，如果pH不准，需要校准pH，否则会对培养基产生影响，容易滋生细菌。在灭菌过程中一些重要的营养成分、激素和抗生素等会随着高温而分解而失效，如IAA、ZT、ABA等，不能同培养基一起高压灭菌，而需要单独进行过滤灭菌。培养基在使用之前需要高压蒸汽灭菌，121 ℃，保证灭菌时间20 min，可完全灭杀菌微生物、芽孢和孢子，然后将灭过菌的培养基放在组培室或相对无菌的环境中，冷却后待用。一般情况下未接种的培养基放置不能超过5 天，在这期间，如果发现培养基有污染，应丢弃，并及时分析确定污染源，有针对性地加以改进，防止二次污染[2]。
在一些需要大量接种的实验中，由于分批分期操作而持续时间较长。可以将培养基密封好，在冰箱中保鲜，使营养成分不丢失。如果在接种前培养基出现大量污染现象，一般有两种情况：菌类存在于培养基表面是真菌时，可能是因密封不严或环境不洁净引起，菌类种群密度过大所致。若菌类存在于培养基内部，使用污染的贮藏母液，培养瓶不洁净，灭菌不彻底等引起。防治的方法是：保持环境洁净，杜绝使用污染的母液。
接种污染的防治[4]
接种器械和器皿的灭菌
接种器械包括解剖剪、解剖刀、镊子，接种器皿包括接种盘、培养皿等。操作过程中，这些物品直接与外植体接触，必须经过严格灭菌才能使用。灭菌方法湿热灭菌法为：用牛皮纸将接种器械和器皿包好，放在高压灭菌锅中，121 ℃灭菌20 min，然后放在干燥箱内进行干燥。干燥后放在超净工作台上待用。使用前需要火焰灭菌，先用酒精棉球将接种器械从尖端到末端擦拭，酒精挥净后在酒精灯外焰灼烧，待冷却之后备用。在接种过程中，每用一次接种器械都要灭菌。
外植体的获取
外植体的获取通常在晴天，应避免在连续阴雨的情况下取材，因为在植物茎叶表面容易滋生大量的微生物，一些菌丝体甚至侵入表皮内的薄壁组织，不能被一般的表面消毒方法所清除，材料被带入组织培养过程中易引起内生菌的污染。因此，必须选择合适的外植体（如成熟的种子、健壮植株等），以污染少、易启动、易培养、分化率高为原则。迄今为止，组织培养获得的成功，几乎包括了植物体的各个部位，胚、茎尖、成熟种子培育成无菌苗，然后采用无菌芽苗的胚轴、胚根、子叶等为材料，也可减少污染。选择不易污染且易表达全能性的外植体，是成功建立组织培养体系的主要因素之一。
外植体消毒与接种
外植体灭菌方法有表面灭菌和深层灭菌。如以茎尖、茎段和叶片等为较嫩的外植体材料时，常用表面灭菌方法：先用自来水冲洗数分钟，再浸泡到70%的酒精中，用无菌水冲洗2～3 次；再用表面消毒剂如0.1%～0.5%氯化汞或1%～2%（体积/重量）溴水或2%～10%次氯酸钠浸泡。若材料表面不光滑，可以在灭菌液中加入1～2 滴表面活性剂，如吐温80或吐温20，达到更好的消毒效果。消毒后用无菌水充分冲洗3～4 次后，用无菌虑纸吸干，在无菌条件下用解剖刀切取所需大小的茎尖、茎段，将切割好的外植体置于培养基表面，包上封口膜，放到培养架上进行培养。一般的灭菌材料灭菌时间的长短以及灭菌剂浓度的高低以不同外植体而定，时间过长浓度过高有可能造成植物体伤害，过低或者过短达不到抑菌的效果 。
被菌污染的组培苗和组培瓶的处理
即使操作很认真，有时仍然会出现污染现象。造成污染的病原主要分为细菌和真菌两大类。真菌性污染主要指霉菌引起的污染。真菌污染主要来源于环境，细菌污染主要来源于接种材料及工具。组培瓶内组培苗的污染多在接种后2～3 天开始出现，真菌污染一般在接种后3～5 天后出现。培养材料附近出现粘液状和泡沫状，或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。为达到最佳消毒效果，对于材料内部带菌的组织，有时还需在培养基中加入适量抗生素。污染的组织要及时的处理、高压灭菌，防止污染扩散。
【参考文献】
[1] 邵龙珠，赵淑君，王淑荣，刘金华.植物组织培养中的常见问题与解决技术措施[J].林业勘查设计，2012 （1）：49-51.
[2] 彭立群，田子珩，张俊琦.植物组培中污染发生原因及防治技术研究进展[J].广东林业科技，2012，28 （1）：82-86.
[3] 胡凯，张立军，白雪梅.植物组织培养污染原因分析及外植体的消毒[J].安徽农业科学，2007， 35（3）： 680- 681.
[4] 李洪波.植物组织培养操作技术[J].中国花卉盆景，2002（1）：30-31.
[5] 叶添谋.植物组织培养过程中的常见技术难题研究进展[J].韶关学院学报，2010，31（3）：84-90.