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摘要：核桃细菌性黑斑病严重影响着核桃的产量和品质，是核桃生产过程中危害较为严重的病害之一。植物病原真菌、细菌以及卵菌的分泌蛋白质在其致病过程中发挥着重要的作用。本研究以核桃细菌性黑斑病菌CFBP2528CFBP7179、CFBP8253、DW3F3.JI303、NCPPB1447、Xaj4177个菌株分泌蛋白质氨基酸序列为基础数据，利用蛋白质数据库、PHD、Protscale、TargetP1.1Server、SMART等网站在线预测分析其理化性质、二级结构、疏水性、转运肽及保守结构域等性质，明确核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质所具有的特征。结果表明，在所分析的7个菌株520个分泌蛋白质中，分泌蛋白质的理论等电点集中在6.01～7.00，蛋白质数量所占比例为26.92%;不稳定性系数集中在20.01～40.00，其蛋白质数量所占比例为63.65%;亲水值小于0的蛋白质数量所占比例为76.51%，亲水性最强的氨基酸残基中数量最多的是D，所占比例为13.64%，疏水性最强的氨基酸残基中数量最多的是L，所占比例为29.58%;分泌蛋白质均含有无规则卷曲、a螺旋、β折叠、TM（跨膜螺旋）二级结构，其所占比例分别为27.56%、27.17%、26.45%、1.03%;转运肽集中在分泌通路，其所占比例为95.38%;每个菌株平均有16个分泌蛋白质具有保守结构域，所占比例为21.35%。上述研究结果为深入解析核桃细菌性黑斑病菌分泌蛋白质的功能冗余性和多样性奠定了基础。
关键词：核桃细菌性黑斑病菌;分泌蛋白;理化性质;生物信息学分析
中图分类号：S664.1
文献标识码：A
文章编号：1000-4440（2019）02-0295-07
核桃作为中国第一大干果树种，其在经济林产业服务国家经济发展和生态保障方面发挥着重要作用，目前，中国在核桃种植面积和产量方面均居世界第一，作为核桃的种植面积（2.87x106 hm2）、产量（1.15x106t）、产值（3.15x1010元）均居全国之首的重要省份——云南省，近些年，大力发展核桃产业[1]。云南省129个县（市、区）中90%以上种植核桃，核桃产业已惠及2.6x106多名山区群众，成为云南省覆盖面最广，汇集群众最多，持续发展潜力最大的高原特色产业之一。然而，近些年对中国核桃第一州（市）——云南省大理州核桃主要生产区开展核桃病害调研，发现核桃炭疽病、核桃细菌性黑斑病等病害发生日益严重[2-3]。
学术界有关核桃细菌性黑斑病菌的报道尤以核桃黄单胞杆菌（Xanthomonas arboricola pv. juglandis）报道为主（46]，受该病菌侵染的核桃，果实容易腐烂、早落，出仁率和含油率均降低，核桃品质下降并减产，严重时落果率高达60%～80%。前期通过对X.arboricola pv. juglandis（菌株编号分别为CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj417）开展分泌蛋白质预测，以分泌蛋白质所具有的特征（N-端含有信号肽、不含有跨膜结构域、没有GPI锚定位点、将蛋白质分泌在胞外）为依据，利用SignalP v4.1、ProtCompB v9.0、TM-HMM v2.0、big-PI Fungal predictor TargetP v1.1等生物信息学分析程序進行分析，明确上述7个菌株中含有的分泌蛋白质数量分别为76个、79个、77个、78个、67个、75个、68个，平均为74个。分泌蛋白质在植物病原菌侵染植物过程中发挥着重要的作用，逐渐成为植物病理学研究的热点之一[7]，有关植物病原真菌（禾谷炭疽菌[8]、希金斯炭疽菌[9]、稻瘟菌[10]、大丽轮枝菌[1]、香蕉枯萎病菌[12]）、植物病原卵菌（樟疫霉[13]、致病疫霉[14]）、植物病原细菌（枯草芽孢杆菌BEST195[15]、结核分枝杆菌[16]、香蕉细菌性软腐病菌[17]、茄青枯病菌以[18]及丁香假单胞杆菌番茄致病变种[19]）的分泌蛋白质己经明确。然而，国内外对于植物病原细菌特别是经济林木上病原细菌分泌蛋白质的研究尚不够深入[7]，尚未见到对核桃细菌性黑斑病菌分泌蛋白质理化性质及特征的分析报道[20]。
本研究基于前期的研究基础，对核桃细菌性黑斑病菌中分泌蛋白质的理化性质、不稳定系数、疏水性、二级结构、转运肽及保守结构域开展生物信息学分析，以期为核桃细菌性黑斑病的深入研究和有效防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 分泌蛋白质来源
核桃细菌性黑斑病菌的全蛋白质组序列来源于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Xanthom-onas arboricola pv. juglandis）。对X.arboricolapv.juglandis（菌株编号分别为CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj417）开展分泌蛋白质预测，获得7个菌株的520个分泌蛋白质氨基酸序列。
1.2 分泌蛋白质性质分析
运用蛋白质数据库（https：//web.expasy.org/protparam/）分析分泌蛋白质的理化性质，包括理论等电点、不稳定性系数、总平均亲水性等，采用PHD（htp：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）分析分泌蛋白质的二级结构，采用Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析分泌蛋白质的疏水性，采用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析分泌蛋白质的转运肽，采用SMART（http：//smart.embl-heidel-berg.de/）分析分泌蛋白质的保守结构域，然后对分析数据进行整理归纳。 2 结果
2.1 分泌蛋白质的理论等电点
通过对核桃细菌性黑斑病菌CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj4177个菌株的520个分泌蛋白质所具有的理论等电点数值进行分析，CFBP2528菌株的分泌蛋白质WP_039528270.1（ID号）具有最低理论等电点，为4.14;CFBP7179菌株的分泌蛋白质WP_047130622.1（ID号）具有最高理论等电点，为11.71。将上述分泌蛋白质，以理论等电点1.00为1个间隔单位，对其进行归类分析，结果表明，核桃细菌性黑斑病菌分泌蛋白质理论等电点主要集中于6.01～7.00，其数量为140个，所占比例为26.92%;理论点为5.01～6.00的分泌蛋白质有16个，所占比例为22.12%。同时，对属于酸性蛋白质（理论等电点小于6.01）的分泌蛋白质进行分析，其数量平均为21个，所占比例为28.46%;对属于中性蛋白（理论等电点位于6.01～8.00）的分泌蛋白进行分析，其数量平均为26个，所占比例为35.00%;对属于碱性蛋白质（理论等电点大于8.00）的分泌蛋白质进行分析，其数量平均为27个，所占比例为36.54%（图1）。上述结果表明核桃细菌性黑斑病菌7个菌株的分泌蛋白质中酸性蛋白质、中性蛋白质.碱性蛋白质数量分布较为均匀，所占比例为1.00：1.23：1.28。
2.2 分泌蛋白质的不稳定性系数
对520个分泌蛋白质的不稳定性系数进行统计分析，结果表明，分泌蛋白质的不稳定性系数集中在20.01～40.00（所占比例为63.65%）。同时，不稳定性系数小于40.01（稳定蛋白质）的分泌蛋白质有51个，所占比例为68.65%;不稳定性系数大于40.01（不稳定蛋白质）的分泌蛋白质有23个，所占比例为31.35%（图2）。上述结果表明，核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质多属于稳定蛋白质。
2.3 分泌蛋白质的亲水性
对核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质的亲水性进行统计分析，结果表明，分泌蛋白质多数属于亲水性蛋白（亲水性值小于0），其数量有57个，所占比例为76.54%;同时，疏水性蛋白质（亲水性值大于0）数量有17个，所占比例为23.46%（图3）。上述结果表明，核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质多数属于亲水性蛋白质。
此外，对分泌蛋白质的疏水性进行统计分析，结果表明，分泌蛋白質中亲水性蛋白质有56个，所占比例为75.96%，疏水性蛋白质有18个，所占比例为24.04%。对分泌蛋白质亲水性最强氨基酸残基、疏水性最强氨基酸残基种类进行统计分析，明确前者有17种氨基酸残基，缺少F（苯丙氨酸）、I（异亮氨酸）、W（色氨酸）3种氨基酸残基，存在较多的是D（天冬氨酸）、R（精氨酸）、G（甘氨酸）3种氨基酸残基，所占比例分别为13.64%、9.44%.9.27%（图4）;后者有13种氨基酸残基，缺少E（谷氨酸）、H（组氨酸）、K（赖氨酸）、N（天冬酰胺）、Q（谷氨酰胺）、R、W、Y（酪氨酸）等氨基酸残基，存在较多的是L（亮氨酸）、A（丙氨酸）、V（缬氨酸）3种氨基酸残基，所占比例分别为29.58%、26.92%、11.27%（图4）。
2.4 分泌蛋白质二级结构组成特征
对核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质进行二级结构预测并统计分析，结果表明，分泌蛋白质均含有无规则卷曲、a螺旋β折叠、TM（跨膜螺旋）等结构，平均所占比例分别为27.56%、27.17%、26.45%、1.03%，即比例为1.000：0.986：0.960：0.037。同时，对分泌蛋白质中的酸性蛋白质、中性蛋白质及碱性蛋白质二级结构组成进行统计分析，就无规则卷曲、a螺旋β折叠、TM（跨膜螺旋）等结构组成比例而言，在酸性蛋白质中所占比例分别为27.70%、27.09%、28.05%、0.92%;在中性蛋白质中所占比例分别为24.35%、27.32%、24.99%、1.05%;在碱性蛋白质中所占比例分别为30.54%、27.08%、26.59%、1.09%（图5）。因此，核桃细菌性黑斑病菌分泌蛋白质的酸性蛋白质二级结构组成尤以β折叠为主、以跨膜螺旋结构较少为特征，中性蛋白质二级结构组成则以跨膜螺旋结构较少为特征，碱性蛋白质二级结构组成则以无规则卷曲较多为特征。
2.5 分泌蛋白质的转运肽
对核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质的转运肽预测分析，明确分泌蛋白质的线粒体靶向肽预测值、信号肽预测值、定位情况和预测可靠性。其中转运肽定位分布（图6）中，平均有71个定位在分泌通道、3个定位在线粒体，所占比例分别为95.38%、4.23%，CFBP2528和Xaj417还含有1个其他位置，占比为0.38%;同时，就预测结果可靠性而言，平均有58个分泌蛋白质的预测可靠性大于0.600，所占比例为78.46%，有4个分泌蛋白质的预测可靠性小于0.200，所占比例为5.19%。
2.6 分泌蛋白质的保守结构域
通过对核桃细菌性黑斑病菌的520个分泌蛋白质开展保守结构域的预测及分析，发现有111个分泌蛋白质存在明显的保守结构域，即每个菌株平均有16个分泌蛋白质具有明显的保守结构域（图7），所占比例为21.35%。不同菌株分泌蛋白质所存在的保守结构域种类和数量不尽相同，主要涉及的种类有24种，最少的类别涉及数量仅为1个，最多的类别涉及的数量为14个。
3 讨论
本研究基于前期的研究基础，明确核桃细菌性黑斑病菌CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3J303、NCPPB1447、Xaj417等7个菌株的分泌蛋白质所具有的理化性质及特征，酸性蛋白质、中性蛋白质、碱性蛋白质数量分布较为均匀，数量所占比例为1.00：1.23：1.28;尤以稳定蛋白质、亲水性蛋白质居多;亲水性最强的氨基酸残基数量较多的是D、G、R3种氨基酸残基，疏水性最强的氨基酸残基数量较多的是L、A、V3种氨基酸残基;均存在无规则卷曲、a螺旋β折叠、跨膜螺旋等二级结构，所占比例为1.000：0.986：0.959：0.037;拥有明显保守结构域的分泌蛋白质所占比例较低。 近些年，学术界对核桃细菌性黑斑病菌的报道涉及树生黄单胞菌胡桃变种（Xanthomonas campestrispv. juglandis）[21-22]、成团泛菌（Pantoea agglomerans）以及上述细菌的复合[23]等，本研究仅对X. ar-boricola pv. juglandi的分泌蛋白质开展了生物信息学分析，上述其他致病菌的分泌蛋白质及其理化性质情况如何，尚需进一步明确。同时，本研究采用对比分析和平均值的方法对X. arboricola pv. juglandi的7个菌株的分泌蛋白质进行分析，初步明确了核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质的理化性质及其特征。目前，国内外有关植物病原菌（真菌、细菌、卵菌等）分泌蛋白质的预测报道大多集中在某一个菌株开展[8-20]，本研究对同一种病原菌的几个菌株分泌蛋白质的预测尚属首次，具有一定的创新性，但采用不同菌株分泌蛋白质特征值的平均数来衡量其理化性质，其准确性有待于进一步验证。
此外，本研究明确了7个X. arboricola pv. juglandi菌株的分泌蛋白质数量平均为74个，以碱性蛋白质、稳定蛋白质、亲水性蛋白质居多，二级结构中跨膜螺旋较少，保守结构域的种类和数量较少。就单个菌株的分泌蛋白质所具有的特征而言，亲水性蛋白质的比例为70.59%～83.12%，酸性蛋白质的比例为25.00%～31.65%，中性蛋白质的比例为32.89%～36.76%，碱性蛋白质的比例为33.77%～42.11%，二级结构中无规则螺旋的比例为26.23%～30.06%，a螺旋的比例为25.81%～29.49%，β折叠的比例为25.14%～28.18%，TM的比例分布为0.85%～1.28%，转运肽定位在分泌通路的比例为92.21%～97.37%，定位在线粒体的比例为1.32%～7.79%，保守结构域的数量为13～18个。推测上述不同菌株之间分泌蛋白质理化性质特征差异的原因与菌株的生存环境、培养因素等有关。
通过对X.arboricolapv.juglandi的分泌蛋白质的疏水性进行分析，明确亲水性蛋白和疏水性蛋白质平均有56个和18个，然而，通过蛋白质数据库在线分析理化性质，明确亲水性蛋白质和疏水性蛋白质平均有57个和17个，上述2种不同的预测方法导致了不同的结果。具体而言，在上述2种预测方法中，有19个分泌蛋白质的疏水性结果存在差异性，分别为CFBP2528菌株（WP_016901454.1）、CFBP7179菌株（WP_016901454.1、WP_016902921.1、WP_026064112.1）、CFBP8253菌株（WP016901454.1、WP_016902921.1、WP_026064112.1、WP_053045589.1）、DW3F3菌株（PMR89132.1、PMR89352.1、PMR89417.1）、J303菌株（0AH79955.1、0AH79250.1、0AH76971.1）、NCPPB1447菌株（WP_016901454.1、WP_016902921.1、WP026064112.1、WP_026064348.1）、Xaj417菌株（AKU51471.1），进一步对比分析，发现2种方法所预测的值相差最小为0.183，相差最大为12.992，造成上述差异的原因有待进一步明确。
同时，对核桃细菌性黑斑病菌分泌蛋白质所具有的保守结构域进行分析，具有明显保守结构域的分泌蛋白质所占比例仅为21.35%，推测上述具有不同结构域的分泌蛋白质在实现核桃细菌性黑斑病菌侵染核桃后所具有的功能具有多样性特点。
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关键词：核桃细菌性黑斑病菌;分泌蛋白;理化性质;生物信息学分析
中图分类号：S664.1
文献标识码：A
文章编号：1000-4440（2019）02-0295-07
核桃作为中国第一大干果树种，其在经济林产业服务国家经济发展和生态保障方面发挥着重要作用，目前，中国在核桃种植面积和产量方面均居世界第一，作为核桃的种植面积（2.87x106 hm2）、产量（1.15x106t）、产值（3.15x1010元）均居全国之首的重要省份——云南省，近些年，大力发展核桃产业[1]。云南省129个县（市、区）中90%以上种植核桃，核桃产业已惠及2.6x106多名山区群众，成为云南省覆盖面最广，汇集群众最多，持续发展潜力最大的高原特色产业之一。然而，近些年对中国核桃第一州（市）——云南省大理州核桃主要生产区开展核桃病害调研，发现核桃炭疽病、核桃细菌性黑斑病等病害发生日益严重[2-3]。
学术界有关核桃细菌性黑斑病菌的报道尤以核桃黄单胞杆菌（Xanthomonas arboricola pv. juglandis）报道为主（46]，受该病菌侵染的核桃，果实容易腐烂、早落，出仁率和含油率均降低，核桃品质下降并减产，严重时落果率高达60%～80%。前期通过对X.arboricola pv. juglandis（菌株编号分别为CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj417）开展分泌蛋白质预测，以分泌蛋白质所具有的特征（N-端含有信号肽、不含有跨膜结构域、没有GPI锚定位点、将蛋白质分泌在胞外）为依据，利用SignalP v4.1、ProtCompB v9.0、TM-HMM v2.0、big-PI Fungal predictor TargetP v1.1等生物信息学分析程序進行分析，明确上述7个菌株中含有的分泌蛋白质数量分别为76个、79个、77个、78个、67个、75个、68个，平均为74个。分泌蛋白质在植物病原菌侵染植物过程中发挥着重要的作用，逐渐成为植物病理学研究的热点之一[7]，有关植物病原真菌（禾谷炭疽菌[8]、希金斯炭疽菌[9]、稻瘟菌[10]、大丽轮枝菌[1]、香蕉枯萎病菌[12]）、植物病原卵菌（樟疫霉[13]、致病疫霉[14]）、植物病原细菌（枯草芽孢杆菌BEST195[15]、结核分枝杆菌[16]、香蕉细菌性软腐病菌[17]、茄青枯病菌以[18]及丁香假单胞杆菌番茄致病变种[19]）的分泌蛋白质己经明确。然而，国内外对于植物病原细菌特别是经济林木上病原细菌分泌蛋白质的研究尚不够深入[7]，尚未见到对核桃细菌性黑斑病菌分泌蛋白质理化性质及特征的分析报道[20]。
本研究基于前期的研究基础，对核桃细菌性黑斑病菌中分泌蛋白质的理化性质、不稳定系数、疏水性、二级结构、转运肽及保守结构域开展生物信息学分析，以期为核桃细菌性黑斑病的深入研究和有效防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 分泌蛋白质来源
核桃细菌性黑斑病菌的全蛋白质组序列来源于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Xanthom-onas arboricola pv. juglandis）。对X.arboricolapv.juglandis（菌株编号分别为CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj417）开展分泌蛋白质预测，获得7个菌株的520个分泌蛋白质氨基酸序列。
1.2 分泌蛋白质性质分析
运用蛋白质数据库（https：//web.expasy.org/protparam/）分析分泌蛋白质的理化性质，包括理论等电点、不稳定性系数、总平均亲水性等，采用PHD（htp：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）分析分泌蛋白质的二级结构，采用Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析分泌蛋白质的疏水性，采用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析分泌蛋白质的转运肽，采用SMART（http：//smart.embl-heidel-berg.de/）分析分泌蛋白质的保守结构域，然后对分析数据进行整理归纳。 2 结果
2.1 分泌蛋白质的理论等电点
通过对核桃细菌性黑斑病菌CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj4177个菌株的520个分泌蛋白质所具有的理论等电点数值进行分析，CFBP2528菌株的分泌蛋白质WP_039528270.1（ID号）具有最低理论等电点，为4.14;CFBP7179菌株的分泌蛋白质WP_047130622.1（ID号）具有最高理论等电点，为11.71。将上述分泌蛋白质，以理论等电点1.00为1个间隔单位，对其进行归类分析，结果表明，核桃细菌性黑斑病菌分泌蛋白质理论等电点主要集中于6.01～7.00，其数量为140个，所占比例为26.92%;理论点为5.01～6.00的分泌蛋白质有16个，所占比例为22.12%。同时，对属于酸性蛋白质（理论等电点小于6.01）的分泌蛋白质进行分析，其数量平均为21个，所占比例为28.46%;对属于中性蛋白（理论等电点位于6.01～8.00）的分泌蛋白进行分析，其数量平均为26个，所占比例为35.00%;对属于碱性蛋白质（理论等电点大于8.00）的分泌蛋白质进行分析，其数量平均为27个，所占比例为36.54%（图1）。上述结果表明核桃细菌性黑斑病菌7个菌株的分泌蛋白质中酸性蛋白质、中性蛋白质.碱性蛋白质数量分布较为均匀，所占比例为1.00：1.23：1.28。
2.2 分泌蛋白质的不稳定性系数
对520个分泌蛋白质的不稳定性系数进行统计分析，结果表明，分泌蛋白质的不稳定性系数集中在20.01～40.00（所占比例为63.65%）。同时，不稳定性系数小于40.01（稳定蛋白质）的分泌蛋白质有51个，所占比例为68.65%;不稳定性系数大于40.01（不稳定蛋白质）的分泌蛋白质有23个，所占比例为31.35%（图2）。上述结果表明，核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质多属于稳定蛋白质。
2.3 分泌蛋白质的亲水性
对核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质的亲水性进行统计分析，结果表明，分泌蛋白质多数属于亲水性蛋白（亲水性值小于0），其数量有57个，所占比例为76.54%;同时，疏水性蛋白质（亲水性值大于0）数量有17个，所占比例为23.46%（图3）。上述结果表明，核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质多数属于亲水性蛋白质。
此外，对分泌蛋白质的疏水性进行统计分析，结果表明，分泌蛋白質中亲水性蛋白质有56个，所占比例为75.96%，疏水性蛋白质有18个，所占比例为24.04%。对分泌蛋白质亲水性最强氨基酸残基、疏水性最强氨基酸残基种类进行统计分析，明确前者有17种氨基酸残基，缺少F（苯丙氨酸）、I（异亮氨酸）、W（色氨酸）3种氨基酸残基，存在较多的是D（天冬氨酸）、R（精氨酸）、G（甘氨酸）3种氨基酸残基，所占比例分别为13.64%、9.44%.9.27%（图4）;后者有13种氨基酸残基，缺少E（谷氨酸）、H（组氨酸）、K（赖氨酸）、N（天冬酰胺）、Q（谷氨酰胺）、R、W、Y（酪氨酸）等氨基酸残基，存在较多的是L（亮氨酸）、A（丙氨酸）、V（缬氨酸）3种氨基酸残基，所占比例分别为29.58%、26.92%、11.27%（图4）。
2.4 分泌蛋白质二级结构组成特征
对核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质进行二级结构预测并统计分析，结果表明，分泌蛋白质均含有无规则卷曲、a螺旋β折叠、TM（跨膜螺旋）等结构，平均所占比例分别为27.56%、27.17%、26.45%、1.03%，即比例为1.000：0.986：0.960：0.037。同时，对分泌蛋白质中的酸性蛋白质、中性蛋白质及碱性蛋白质二级结构组成进行统计分析，就无规则卷曲、a螺旋β折叠、TM（跨膜螺旋）等结构组成比例而言，在酸性蛋白质中所占比例分别为27.70%、27.09%、28.05%、0.92%;在中性蛋白质中所占比例分别为24.35%、27.32%、24.99%、1.05%;在碱性蛋白质中所占比例分别为30.54%、27.08%、26.59%、1.09%（图5）。因此，核桃细菌性黑斑病菌分泌蛋白质的酸性蛋白质二级结构组成尤以β折叠为主、以跨膜螺旋结构较少为特征，中性蛋白质二级结构组成则以跨膜螺旋结构较少为特征，碱性蛋白质二级结构组成则以无规则卷曲较多为特征。
2.5 分泌蛋白质的转运肽
对核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质的转运肽预测分析，明确分泌蛋白质的线粒体靶向肽预测值、信号肽预测值、定位情况和预测可靠性。其中转运肽定位分布（图6）中，平均有71个定位在分泌通道、3个定位在线粒体，所占比例分别为95.38%、4.23%，CFBP2528和Xaj417还含有1个其他位置，占比为0.38%;同时，就预测结果可靠性而言，平均有58个分泌蛋白质的预测可靠性大于0.600，所占比例为78.46%，有4个分泌蛋白质的预测可靠性小于0.200，所占比例为5.19%。
2.6 分泌蛋白质的保守结构域
通过对核桃细菌性黑斑病菌的520个分泌蛋白质开展保守结构域的预测及分析，发现有111个分泌蛋白质存在明显的保守结构域，即每个菌株平均有16个分泌蛋白质具有明显的保守结构域（图7），所占比例为21.35%。不同菌株分泌蛋白质所存在的保守结构域种类和数量不尽相同，主要涉及的种类有24种，最少的类别涉及数量仅为1个，最多的类别涉及的数量为14个。
3 讨论
本研究基于前期的研究基础，明确核桃细菌性黑斑病菌CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3J303、NCPPB1447、Xaj417等7个菌株的分泌蛋白质所具有的理化性质及特征，酸性蛋白质、中性蛋白质、碱性蛋白质数量分布较为均匀，数量所占比例为1.00：1.23：1.28;尤以稳定蛋白质、亲水性蛋白质居多;亲水性最强的氨基酸残基数量较多的是D、G、R3种氨基酸残基，疏水性最强的氨基酸残基数量较多的是L、A、V3种氨基酸残基;均存在无规则卷曲、a螺旋β折叠、跨膜螺旋等二级结构，所占比例为1.000：0.986：0.959：0.037;拥有明显保守结构域的分泌蛋白质所占比例较低。 近些年，学术界对核桃细菌性黑斑病菌的报道涉及树生黄单胞菌胡桃变种（Xanthomonas campestrispv. juglandis）[21-22]、成团泛菌（Pantoea agglomerans）以及上述细菌的复合[23]等，本研究仅对X. ar-boricola pv. juglandi的分泌蛋白质开展了生物信息学分析，上述其他致病菌的分泌蛋白质及其理化性质情况如何，尚需进一步明确。同时，本研究采用对比分析和平均值的方法对X. arboricola pv. juglandi的7个菌株的分泌蛋白质进行分析，初步明确了核桃细菌性黑斑病菌的分泌蛋白质的理化性质及其特征。目前，国内外有关植物病原菌（真菌、细菌、卵菌等）分泌蛋白质的预测报道大多集中在某一个菌株开展[8-20]，本研究对同一种病原菌的几个菌株分泌蛋白质的预测尚属首次，具有一定的创新性，但采用不同菌株分泌蛋白质特征值的平均数来衡量其理化性质，其准确性有待于进一步验证。
此外，本研究明确了7个X. arboricola pv. juglandi菌株的分泌蛋白质数量平均为74个，以碱性蛋白质、稳定蛋白质、亲水性蛋白质居多，二级结构中跨膜螺旋较少，保守结构域的种类和数量较少。就单个菌株的分泌蛋白质所具有的特征而言，亲水性蛋白质的比例为70.59%～83.12%，酸性蛋白质的比例为25.00%～31.65%，中性蛋白质的比例为32.89%～36.76%，碱性蛋白质的比例为33.77%～42.11%，二级结构中无规则螺旋的比例为26.23%～30.06%，a螺旋的比例为25.81%～29.49%，β折叠的比例为25.14%～28.18%，TM的比例分布为0.85%～1.28%，转运肽定位在分泌通路的比例为92.21%～97.37%，定位在线粒体的比例为1.32%～7.79%，保守结构域的数量为13～18个。推测上述不同菌株之间分泌蛋白质理化性质特征差异的原因与菌株的生存环境、培养因素等有关。
通过对X.arboricolapv.juglandi的分泌蛋白质的疏水性进行分析，明确亲水性蛋白和疏水性蛋白质平均有56个和18个，然而，通过蛋白质数据库在线分析理化性质，明确亲水性蛋白质和疏水性蛋白质平均有57个和17个，上述2种不同的预测方法导致了不同的结果。具体而言，在上述2种预测方法中，有19个分泌蛋白质的疏水性结果存在差异性，分别为CFBP2528菌株（WP_016901454.1）、CFBP7179菌株（WP_016901454.1、WP_016902921.1、WP_026064112.1）、CFBP8253菌株（WP016901454.1、WP_016902921.1、WP_026064112.1、WP_053045589.1）、DW3F3菌株（PMR89132.1、PMR89352.1、PMR89417.1）、J303菌株（0AH79955.1、0AH79250.1、0AH76971.1）、NCPPB1447菌株（WP_016901454.1、WP_016902921.1、WP026064112.1、WP_026064348.1）、Xaj417菌株（AKU51471.1），进一步对比分析，发现2种方法所预测的值相差最小为0.183，相差最大为12.992，造成上述差异的原因有待进一步明确。
同时，对核桃细菌性黑斑病菌分泌蛋白质所具有的保守结构域进行分析，具有明显保守结构域的分泌蛋白质所占比例仅为21.35%，推测上述具有不同结构域的分泌蛋白质在实现核桃细菌性黑斑病菌侵染核桃后所具有的功能具有多样性特点。
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