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摘 要：Fmoc是一种常用的氨基保护基，传统的脱除方法是通过加入二级胺与之作用来实现。针对方法中存在的成本较高、使用的过量二级胺不易回收以及污染环境等缺点，建立了利用新型无机碱纳米碳酸钾非均相脱除Fmoc保护基的新方法。采用湿法研磨方法，将普通碳酸钾制成粒径为64 nm的纳米碳酸钾，以Fmoc保护的L-苯丙氨酸的脱保护反应为Model反应，确定了最佳反应条件：反应溶剂为无水乙醇，Fmoc-L-Phe-OBn与纳米碳酸钾物质的量比为1︰2，反应温度为25 ℃，高产率得到了相应的游离氨基化合物，进一步研究了新方法的适用范围，对7个Fmoc保护的氨基酸和二肽的底物进行了测试。结果表明，产率均在98%以上，且纳米碳酸钾能够回收再利用，在5次之内的活性几乎没有变化。新方法具有操作简单、成本低、污染小、碳酸钾可回收利用的优点，对多肽的合成及脱保护研究有重要的参考价值。
关键词：有机合成化学； 纳米碳酸钾；Fmoc；脱保护；氨基酸； 肽
中图分类号：O621 文献标志码：A
文章编号：1008-1542（2018）03-0243-06
芴甲氧甲酰基（Fmoc）是一种重要的氨基保护基，对碱较为敏感，在有机合成反应尤其是肽类化合物的合成中应用广泛[1-7]。 Fmoc能够与对酸敏感的保护基Boc和Dmb，以及易氢解的保护基Cbz和Bn形成互补[8-11]。脱除Fmoc的经典方法是使用二级胺，如哌啶、吗啉、DBU或二乙胺等，在非水解的情况下将被保护的胺转化为游离的氨基化合物[12-15]，但该方法面临成本较高、使用的过量二级胺不易回收会对环境造成污染等缺点[16-17]。近年来，纳米化材料由于自身比表面积的提高，拓宽了应用范围，尤其是在化学、医药、材料等诸多领域中得到了广泛应
用[18-20]。笔者先前报道了一种新型的无机碱——纳米碳酸钾，其平均粒径为64 nm，相比普通的碳酸钾，纳米碳酸钾在固态时显示出更强的碱度，可以代替醇钠（钾）进行活性亚甲基化合物的单烷基化和肟化反应，且属于非均相反应，极易分离[21]。鉴于纳米碳酸钾的这种新特性，本文报道了一种利用纳米碳酸钾代替传统的二级胺非均相脱除Fmoc保护基的新方法。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
NMR用Bruker AVANCE 500 MHz核磁共振仪，瑞士Bruker公司提供；MS用Advion Mass Express液相色谱质谱联用仪，常州阿格拉新材料科技有限公司提供；ZF-2型三用紫外仪，上海市安亭电子仪器公司提供；85-1磁力搅拌器，河南巩义市予华仪器有限公司提供；GZM-5高频共振研磨机，北京开源多邦科技发展有限公司提供。所用试剂为分析纯，均为市场直接购买。
1.2 实验步骤
1.2.1 纳米碳酸钾的制备
将150 g无水碳酸钾、63 mL无水乙醇、0.435 g月桂酸倒入共振研磨机中，将混合物在室温下研磨8 h，获得粒径为64 nm的K2CO3，密封，置于干燥器中备用[19]。
1.2.2 Fmoc保护的氨基酸及二肽的脱除通法
称取1 mmol Fmoc保护的氨基酸苄酯、0.276 g（2 mmol）纳米碳酸钾，加入到100 mL的单口瓶中，加入50 mL无水乙醇，室温搅拌反应6 h后过滤，用无水乙醇洗涤滤饼。将滤液冷却至0 ℃，向其中加入2 mol/L HCl的Et2O溶液（2 mL，4 mmol），搅拌1 h。将滤液旋蒸浓缩，于残留物中加入20 mL的Et2O使其固化结晶，经减压抽滤收集无色固体产物，真空干燥后得到相应的氨基酸或二肽的盐酸盐。反应路线如图1所示。
1.2.3 目标产物的结构表征
L-Leu-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Leu-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到白色固体L-Leu-OBn·HCl，收率为100%。1H-NMR（500 MHz，D2O，298 K） δ： 7.20～7.19（2H，d，J=5.0 Hz，—ArH）；7.18～7.16 （3H，t，J=10.0 Hz，—ArH）；5.34（2H，s，—CH2—）； 3.75～3.73（1H，m，—CH—）； 1.76～1.69（3H，m，—CH—，—CH2—）； 0.99～ 0.97（6H，t，J=10.0 Hz， —CH3）。EMI-MS（m/z）：223.1[M+H]+。
L-Phe-OBn·HCl：依據通法，脱除Fmoc-L-Phe-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到白色固体，收率为99%。1H-NMR（500 MHz， D2O，298 K） δ： 7.65～7.64（4H，d，J=5.0 Hz，—ArH）； 7.58～7.56 （6H，t，J=10.0 Hz， —ArH）； 6.33（2H， s，—CH2—）； 4.58～4.55 （1H，dd，J=15.0 Hz，—CH—）； 3.63～3.43 （2H，m，—CH2）。EMI-MS（m/z）： 257.2[M+H]+。
L-Val-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Val-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到白色固体，收率为99%。1H-NMR（500 MHz， D2O， 298 K） δ： 7.20～7.19 （2H，d，J=5.0 Hz，—ArH）；7.19～7.18 （3H， t， J=5.0 Hz，—ArH）；5.34 （2H， s，—CH2—）； 3.61～3.60 （1H，d，J=5.0 Hz，—CH—）； 2.29～2.25 （1H， m，—CH—）； 1.05～1.03 （3H， d，J=9.5 Hz，—CH3）； 0.99～0.98 （3H， d，J=10.0 Hz，—CH3）。EMI-MS（m/z）： 209.1[M+H]+。 L-Pro-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Pro-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到白色固体，收率为98%。1H-NMR（500 MHz， D2O， 298 K） δ： 7.20～7.19（2H， d，J=5.0 Hz，—ArH）； 7.18～7.17（3H， t，J=5.0 Hz，—ArH）； 5.33（2H， s，—CH2—）； 3.58～3.56（1H，t，J=10 Hz，—CH—）； 2.79～2.76（2H，m， J=15.0 Hz，—CH2）； 2.07～2.05（2H，m，J=10.0 Hz，—CH2—）； 1.63～1.62（2H， m，J=5.0 Hz，—CH2—）。EMI-MS（m/z）：207.6[M+H]+。
L-Gly-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Gly-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到白色固体，收率为99%。1H-NMR（500 MHz， D2O， 298 K） δ： 7.20～7.19（2H，d，J=5.0 Hz，—ArH）； 7.18～7.17（3H，t，J=5.5 Hz，—ArH）； 5.34（2H， s，—CH2—）； 3.61（2H， s，—CH2）。EMI-MS（m/z）：167.1[M+H]+。
L-Leu-L-Phe-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Leu-L-Phe-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到黏稠黄色油状液体，收率为98%。1H-NMR（500 MHz， CD2Cl2， 298 K） δ： 7.28～7.26 （4H， d， J=10.0 Hz，—ArH）； 7.11～7.10 （6H，t，J=5.0 Hz，—ArH）； 4.78～4.76 （1H，q，J=10.0 Hz，—CH—）； 5.34（2H， s，—CH2—）； 4.11（1H， s， —CH2）； 3.12～3.10（2H， d，J=10.0 Hz，—CH2—）； 1.66～1.64（3H， m，—CH2—，—CH—）； 0.89（3H， s，—CH3）。EMI-MS（m/z）：370.2[M+H]+。
L-Pro-L-Leu-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Pro-L-Leu-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到黏稠黄色油状液体，收率为98%。1H-NMR（500 MHz， CD2Cl2， 298 K） δ： 7.21～7.20 （2H， d， J=5.0 Hz，—ArH）； 7.19～7.18（3H， t，J=5.0 Hz，—ArH）； 5.34 （2H， s，—CH2—）； 4.68（1H， s，—CH—）； 4.54～4.52（1H， t，J=10.0 Hz，—CH—）； 3.50（2H， s，—CH2—）； 2.14～2.11（4H， m，—CH2—）； 1.68～1.60（3H， m，—CH2—， —CH—）； 0.92～0.89（3H， q，J=14.5 Hz，—CH3）。EMI-MS（m/z）：319.2[M+H]+。
1.2.4 纳米碳酸钾的回收利用
反应结束后，过滤并用无水乙醇（3×30 mL）洗涤得到的滤饼，常温风干后，经马弗炉中于250 ℃ 煅烧4 h，经回收后得到无水碳酸钾，再次研磨得到纳米碳酸钾，实现利用。
2 结果与讨论
2.1 反应条件的优化
根据前文的实验及分析过程，为了得到理想的结果，需对反应条件进行优化，以下是以Fmoc-L-phe-OBn为例的反应方程式。
由于脱除Fmoc后产生的氨基容易与羧酸甲酯发生反应产生副产物，因此本实验中选择较为稳定的Fmoc-L-Phe-OBn为底物进行反应条件的优化。为了获得理想的反应结果，考察了反应溶剂、纳米碳酸钾的用量以及反应时间对反应收率的影响，结果见表1。
由表1可以看出：1）以市售普通碳酸钠和普通碳酸钾为碱时，反应不发生，而以纳米碳酸钾为碱时，则能顺利进行脱保护反应。相比于普通碳酸钾，纳米碳酸钾拥有更大的比表面积，能够将更多的CO2-3暴露在固体表面，因而展现出更强的碱强度[21]。2）相比于乙腈和DMF，質子极性溶剂乙醇和甲醇能够与纳米碳酸钾的表面电荷形成较强的氢键作用，在反应中阻碍纳米碳酸钾的团聚而导致碱性降低。因此，当以乙醇或甲醇为溶剂时，产率最高。经比较，最终选择了毒性相对小的乙醇。3）当纳米碳酸钾的用量提高到Fmoc-L-Phe-OBn的2倍时，产率从88%升高到96%，继续增加纳米碳酸钾用量，产率基本不再变化。这可能是因为纳米碳酸钾作为碱夺取Fmoc基团次甲基上的质子后，变成碳酸氢钾，碱性变弱而失去再次反应的活性；同时，尽管使用的是纳米碳酸钾，但反应仍属于表面反应，与溶液反应相比，表面碱位点不可能完全暴露出来，所以适当增加碱的用量有助于提高收率。4）当纳米碳酸钾的用量为2 mmol时，反应收率随反应时间的延长而提高，6 h时产率最高，几乎能定量脱除。最终，确定最优反应的条件如下：纳米碳酸钾用量为2 mmol ，无水乙醇为溶剂，反应时间为6 h（实验编号9）。
2.2 反应底物的拓展
为了验证此方法的可行性，需对反应底物进行拓展实验，以下是反应通式。
基于上述纳米碳酸钾为碱脱除Fmoc-L-Phe-OBn中Fmoc保护基的优化反应条件，为了考察其方法的通用性，进一步拓展了7种不同的底物，包括Fmoc保护的氨基酸和二肽，结果如图2所示。
由图2可知，无论是氨基酸还是二肽，所有底物用纳米碳酸钾均可有效脱除Fmoc保护基，所得产物的收率均在98%以上，表明此种方法具有很好的通用性。
2.3 纳米碳酸钾的回收
Fmoc-L-Leu-OBn的脱保护反应完成后，回收纳米碳酸钾，重复进行脱保护反应5次，考察其活性对反应收率的影响，结果如图3所示。 由图3可以看出，纳米碳酸钾在重复使用5次后，产率几乎无变化。相比于传统的胺类化合物，Nano-K2CO3具有回收简单、可重复利用的优点，降低了反应成本，减少了对环境的污染程度。
3 结 语
本实验建立了一种利用纳米碳酸钾脱除Fmoc的新方法。采用纳米级碳酸钾替代传统的有机胺类，对Fmoc保护的氨基酸芐酯和二肽苄酯进行脱保护反应，产率均高于98%。该方法具有操作简单、成本低、污染小以及可重复利用的优点，对多肽的合成及脱保护研究有重要的参考价值。但本研究缺少对其他类型无机碱的考察，有待今后作进一步的探索。
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关键词：有机合成化学； 纳米碳酸钾；Fmoc；脱保护；氨基酸； 肽
中图分类号：O621 文献标志码：A
文章编号：1008-1542（2018）03-0243-06
芴甲氧甲酰基（Fmoc）是一种重要的氨基保护基，对碱较为敏感，在有机合成反应尤其是肽类化合物的合成中应用广泛[1-7]。 Fmoc能够与对酸敏感的保护基Boc和Dmb，以及易氢解的保护基Cbz和Bn形成互补[8-11]。脱除Fmoc的经典方法是使用二级胺，如哌啶、吗啉、DBU或二乙胺等，在非水解的情况下将被保护的胺转化为游离的氨基化合物[12-15]，但该方法面临成本较高、使用的过量二级胺不易回收会对环境造成污染等缺点[16-17]。近年来，纳米化材料由于自身比表面积的提高，拓宽了应用范围，尤其是在化学、医药、材料等诸多领域中得到了广泛应
用[18-20]。笔者先前报道了一种新型的无机碱——纳米碳酸钾，其平均粒径为64 nm，相比普通的碳酸钾，纳米碳酸钾在固态时显示出更强的碱度，可以代替醇钠（钾）进行活性亚甲基化合物的单烷基化和肟化反应，且属于非均相反应，极易分离[21]。鉴于纳米碳酸钾的这种新特性，本文报道了一种利用纳米碳酸钾代替传统的二级胺非均相脱除Fmoc保护基的新方法。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
NMR用Bruker AVANCE 500 MHz核磁共振仪，瑞士Bruker公司提供；MS用Advion Mass Express液相色谱质谱联用仪，常州阿格拉新材料科技有限公司提供；ZF-2型三用紫外仪，上海市安亭电子仪器公司提供；85-1磁力搅拌器，河南巩义市予华仪器有限公司提供；GZM-5高频共振研磨机，北京开源多邦科技发展有限公司提供。所用试剂为分析纯，均为市场直接购买。
1.2 实验步骤
1.2.1 纳米碳酸钾的制备
将150 g无水碳酸钾、63 mL无水乙醇、0.435 g月桂酸倒入共振研磨机中，将混合物在室温下研磨8 h，获得粒径为64 nm的K2CO3，密封，置于干燥器中备用[19]。
1.2.2 Fmoc保护的氨基酸及二肽的脱除通法
称取1 mmol Fmoc保护的氨基酸苄酯、0.276 g（2 mmol）纳米碳酸钾，加入到100 mL的单口瓶中，加入50 mL无水乙醇，室温搅拌反应6 h后过滤，用无水乙醇洗涤滤饼。将滤液冷却至0 ℃，向其中加入2 mol/L HCl的Et2O溶液（2 mL，4 mmol），搅拌1 h。将滤液旋蒸浓缩，于残留物中加入20 mL的Et2O使其固化结晶，经减压抽滤收集无色固体产物，真空干燥后得到相应的氨基酸或二肽的盐酸盐。反应路线如图1所示。
1.2.3 目标产物的结构表征
L-Leu-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Leu-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到白色固体L-Leu-OBn·HCl，收率为100%。1H-NMR（500 MHz，D2O，298 K） δ： 7.20～7.19（2H，d，J=5.0 Hz，—ArH）；7.18～7.16 （3H，t，J=10.0 Hz，—ArH）；5.34（2H，s，—CH2—）； 3.75～3.73（1H，m，—CH—）； 1.76～1.69（3H，m，—CH—，—CH2—）； 0.99～ 0.97（6H，t，J=10.0 Hz， —CH3）。EMI-MS（m/z）：223.1[M+H]+。
L-Phe-OBn·HCl：依據通法，脱除Fmoc-L-Phe-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到白色固体，收率为99%。1H-NMR（500 MHz， D2O，298 K） δ： 7.65～7.64（4H，d，J=5.0 Hz，—ArH）； 7.58～7.56 （6H，t，J=10.0 Hz， —ArH）； 6.33（2H， s，—CH2—）； 4.58～4.55 （1H，dd，J=15.0 Hz，—CH—）； 3.63～3.43 （2H，m，—CH2）。EMI-MS（m/z）： 257.2[M+H]+。
L-Val-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Val-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到白色固体，收率为99%。1H-NMR（500 MHz， D2O， 298 K） δ： 7.20～7.19 （2H，d，J=5.0 Hz，—ArH）；7.19～7.18 （3H， t， J=5.0 Hz，—ArH）；5.34 （2H， s，—CH2—）； 3.61～3.60 （1H，d，J=5.0 Hz，—CH—）； 2.29～2.25 （1H， m，—CH—）； 1.05～1.03 （3H， d，J=9.5 Hz，—CH3）； 0.99～0.98 （3H， d，J=10.0 Hz，—CH3）。EMI-MS（m/z）： 209.1[M+H]+。 L-Pro-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Pro-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到白色固体，收率为98%。1H-NMR（500 MHz， D2O， 298 K） δ： 7.20～7.19（2H， d，J=5.0 Hz，—ArH）； 7.18～7.17（3H， t，J=5.0 Hz，—ArH）； 5.33（2H， s，—CH2—）； 3.58～3.56（1H，t，J=10 Hz，—CH—）； 2.79～2.76（2H，m， J=15.0 Hz，—CH2）； 2.07～2.05（2H，m，J=10.0 Hz，—CH2—）； 1.63～1.62（2H， m，J=5.0 Hz，—CH2—）。EMI-MS（m/z）：207.6[M+H]+。
L-Gly-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Gly-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到白色固体，收率为99%。1H-NMR（500 MHz， D2O， 298 K） δ： 7.20～7.19（2H，d，J=5.0 Hz，—ArH）； 7.18～7.17（3H，t，J=5.5 Hz，—ArH）； 5.34（2H， s，—CH2—）； 3.61（2H， s，—CH2）。EMI-MS（m/z）：167.1[M+H]+。
L-Leu-L-Phe-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Leu-L-Phe-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到黏稠黄色油状液体，收率为98%。1H-NMR（500 MHz， CD2Cl2， 298 K） δ： 7.28～7.26 （4H， d， J=10.0 Hz，—ArH）； 7.11～7.10 （6H，t，J=5.0 Hz，—ArH）； 4.78～4.76 （1H，q，J=10.0 Hz，—CH—）； 5.34（2H， s，—CH2—）； 4.11（1H， s， —CH2）； 3.12～3.10（2H， d，J=10.0 Hz，—CH2—）； 1.66～1.64（3H， m，—CH2—，—CH—）； 0.89（3H， s，—CH3）。EMI-MS（m/z）：370.2[M+H]+。
L-Pro-L-Leu-OBn·HCl：依据通法，脱除Fmoc-L-Pro-L-Leu-OBn中的保护基Fmoc，处理后得到黏稠黄色油状液体，收率为98%。1H-NMR（500 MHz， CD2Cl2， 298 K） δ： 7.21～7.20 （2H， d， J=5.0 Hz，—ArH）； 7.19～7.18（3H， t，J=5.0 Hz，—ArH）； 5.34 （2H， s，—CH2—）； 4.68（1H， s，—CH—）； 4.54～4.52（1H， t，J=10.0 Hz，—CH—）； 3.50（2H， s，—CH2—）； 2.14～2.11（4H， m，—CH2—）； 1.68～1.60（3H， m，—CH2—， —CH—）； 0.92～0.89（3H， q，J=14.5 Hz，—CH3）。EMI-MS（m/z）：319.2[M+H]+。
1.2.4 纳米碳酸钾的回收利用
反应结束后，过滤并用无水乙醇（3×30 mL）洗涤得到的滤饼，常温风干后，经马弗炉中于250 ℃ 煅烧4 h，经回收后得到无水碳酸钾，再次研磨得到纳米碳酸钾，实现利用。
2 结果与讨论
2.1 反应条件的优化
根据前文的实验及分析过程，为了得到理想的结果，需对反应条件进行优化，以下是以Fmoc-L-phe-OBn为例的反应方程式。
由于脱除Fmoc后产生的氨基容易与羧酸甲酯发生反应产生副产物，因此本实验中选择较为稳定的Fmoc-L-Phe-OBn为底物进行反应条件的优化。为了获得理想的反应结果，考察了反应溶剂、纳米碳酸钾的用量以及反应时间对反应收率的影响，结果见表1。
由表1可以看出：1）以市售普通碳酸钠和普通碳酸钾为碱时，反应不发生，而以纳米碳酸钾为碱时，则能顺利进行脱保护反应。相比于普通碳酸钾，纳米碳酸钾拥有更大的比表面积，能够将更多的CO2-3暴露在固体表面，因而展现出更强的碱强度[21]。2）相比于乙腈和DMF，質子极性溶剂乙醇和甲醇能够与纳米碳酸钾的表面电荷形成较强的氢键作用，在反应中阻碍纳米碳酸钾的团聚而导致碱性降低。因此，当以乙醇或甲醇为溶剂时，产率最高。经比较，最终选择了毒性相对小的乙醇。3）当纳米碳酸钾的用量提高到Fmoc-L-Phe-OBn的2倍时，产率从88%升高到96%，继续增加纳米碳酸钾用量，产率基本不再变化。这可能是因为纳米碳酸钾作为碱夺取Fmoc基团次甲基上的质子后，变成碳酸氢钾，碱性变弱而失去再次反应的活性；同时，尽管使用的是纳米碳酸钾，但反应仍属于表面反应，与溶液反应相比，表面碱位点不可能完全暴露出来，所以适当增加碱的用量有助于提高收率。4）当纳米碳酸钾的用量为2 mmol时，反应收率随反应时间的延长而提高，6 h时产率最高，几乎能定量脱除。最终，确定最优反应的条件如下：纳米碳酸钾用量为2 mmol ，无水乙醇为溶剂，反应时间为6 h（实验编号9）。
2.2 反应底物的拓展
为了验证此方法的可行性，需对反应底物进行拓展实验，以下是反应通式。
基于上述纳米碳酸钾为碱脱除Fmoc-L-Phe-OBn中Fmoc保护基的优化反应条件，为了考察其方法的通用性，进一步拓展了7种不同的底物，包括Fmoc保护的氨基酸和二肽，结果如图2所示。
由图2可知，无论是氨基酸还是二肽，所有底物用纳米碳酸钾均可有效脱除Fmoc保护基，所得产物的收率均在98%以上，表明此种方法具有很好的通用性。
2.3 纳米碳酸钾的回收
Fmoc-L-Leu-OBn的脱保护反应完成后，回收纳米碳酸钾，重复进行脱保护反应5次，考察其活性对反应收率的影响，结果如图3所示。 由图3可以看出，纳米碳酸钾在重复使用5次后，产率几乎无变化。相比于传统的胺类化合物，Nano-K2CO3具有回收简单、可重复利用的优点，降低了反应成本，减少了对环境的污染程度。
3 结 语
本实验建立了一种利用纳米碳酸钾脱除Fmoc的新方法。采用纳米级碳酸钾替代传统的有机胺类，对Fmoc保护的氨基酸芐酯和二肽苄酯进行脱保护反应，产率均高于98%。该方法具有操作简单、成本低、污染小以及可重复利用的优点，对多肽的合成及脱保护研究有重要的参考价值。但本研究缺少对其他类型无机碱的考察，有待今后作进一步的探索。
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