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摘要：【目的】明確RNA干扰（RNAi）对绵羊颗粒细胞体外培养过程中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体mRNA表达的影响，为开展VEGF在绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中信号通路的相关研究打下基础。【方法】采用电穿孔技术将针对VEGF两个受体Flt-1和KDR/Flk-1的两条有效双链小RNA导入绵羊颗粒细胞内，利用实时荧光定量PCR检测体外培养绵羊颗粒细胞各培养时间VEGF、Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA表达水平的变化。设定筛选出的Flt-1和KDR/Flk-1有效干扰片段分别为试验组Ⅰ和试验组Ⅱ，两个干扰片段共同作用为试验组Ⅲ，无效的干扰片段为对照组。【结果】绵羊颗粒细胞体外培养过程中，VEGF mRNA在各时间段的相对表达量是Flt-1 mRNA相对表达量的102倍、KDR/Flk-1 mRNA相对表达量的103倍；培养第1 d时，试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组Ⅲ VEGF mRNA相对表达量分别为2.62×10-2、3.54×10-2和2.94×10-2，均极显著高于对照组（P<0.01，下同），3个试验组的VEGF mRNA表达量从第2 d开始降低，直到第6 d 与对照组趋于一致。试验组ⅡFlt-1 mRNA相对表达量从培养第1 d的1.02×10-1逐渐降至第7 d 的8.99×10-4，且一直极显著高于其他组；试验组Ⅰ和试验组Ⅲ在前3 d几乎无Flt-1 mRNA表达，随着培养时间的延长逐渐呈上升趋势，第8 d时各组趋于一致。试验组Ⅰ的KDR/Flk-1 mRNA相对表达量从第1 d开始极显著低于对照组；试验组Ⅱ和试验组Ⅲ在前3 d几乎无KDR/Flk-1 mRNA相对表达，随着培养时间的延长呈上升趋势，第9 d 时各组趋于一致。【结论】两个有效干扰片段在绵羊颗粒细胞体外培养过程中起到很好的干扰作用，可改变VEGF、Flt-1及KDR mRNA的表达量，进而影响颗粒细胞相关生长信号的传输。
关键词： 血管内皮生长因子（VEGF）；血管内皮生长因子受体；RNA干扰（RNAi）；颗粒细胞；绵羊
中图分类号： S826.92 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0336-05
Abstract：【Objective】The paper studied effects of RNA interference（RNAi） on mRNA expression of vascular endothelial growth factor（VEGF） and its receptors in the process of granule cells cultured in vitro， in order to lay a foundation for research in signaling pathway of VEGF during process of oocyte in vitro maturation and embryonic development. 【Method】This research used electroporation to import two double chain small interfering RNA fragments which were designed for VEGF receptors Flt-1 and KDR/Flk-1 into ovine granule cells， and detected Flt-1 mRNA and KDR/Flk-1 mRNA levels variation of ovine granule cells cultured in vitro at different times by real-time quantitative PCR. The researchers named the groups imported with Flt-1 interference fragment and KDR/Flk-1 interference fragment which were screened out in early experiment as treatment group Ⅰand treatment group Ⅱ respectively， and the group imported with both Flt-1 interference fragment and KDR/Flk-1 interference fragment as treatment group Ⅲ， and the group imported with interference fragment which had no RNAi effect as control group. 【Result】Results indicated that， during the process of ovine granule cells cultured in vitro， mRNA expression level of VEGF was 102 times higher than that of Flt-1 and 103 times higher than that of KDR/Flk-1. On the 1st day， the VEGF mRNA expression levels of treatment group Ⅰ， treatment group Ⅱ and treatment group Ⅲ were 2.62×10-2， 3.54×10-2 and 2.94×10-2 respectively， which were significantly higher than that of control group（P<0.01， the same below）. The expression levels of the three treatment groups reduced since the 2nd day and tended to be similar to that of control group on the 6th day. During the culture process， Flt-1 mRNA level of treatment group Ⅱ dropped from 1.02×10-1（on the 1st day） to 8.99×10-4（on the 7th day）， and it had been significantly higher than that of other groups. Flt-1 mRNA expressions of both treatment group Ⅰ and treatment group Ⅲ could be barely detected， then， as time passing by， they rose and tended to be similar to those of other groups on the 8th day. KDR/Flk-1 mRNA level of treatment group Ⅰ was significantly lower than that of control group since the 1st day. KDR/Flk-1 mRNA in both treatment group Ⅱ and treatment group Ⅲ could be barely detected from the 1st day to the 3rd day， and they rose with time passing by and tended to be similar to those of other groups on the 9th day. 【Conclusion】Two pairs of effective interference fragments have good performance on interfering during the process of ovine granule cells in vitro culture， which results in change of mRNA expression levels of VEGF， Flt-1 and KDR mRNA， and affects transmission of growth signal concerning granule cells. Key words： vascular endothelial growth factor（VEGF）； vascular endothelial growth factor receptor； RNA interference（RNAi）； granule cell； ovine
0 引言
【研究意义】Senger等于1983年在肿瘤细胞分泌物中发现了一种促进内皮细胞增生、迁徙，抑制细胞凋亡，提高血管和微血管对大分子物质通透性的生长因子——血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），目前，关于VEGF的研究多集中在人类医学，尤其是肿瘤方面（Espana-Serrano and Chougule，2016；Schicho et al.，2016；Wang et al.，2016）。在本课题组前期研究基础上推断VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育的促进作用可能与颗粒细胞有关，颗粒细胞可通过间隙连接为卵母细胞的成熟提供有利于其代谢的营养物质。因此，探究VEGF对绵羊颗粒细胞的影响，对后期研究VEGF在绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中的信号通路等具有重要意义。【前人研究进展】Otani等（1999）研究推测VEGF可能以旁分泌的形式影响卵泡内血管通透性和血管发生，并以自分泌的方式作用于颗粒细胞和卵泡膜细胞，从而影响卵泡的生长和卵母细胞的成熟。Eppig（2003）研究表明人类颗粒细胞、卵泡膜细胞和卵丘细胞中有VEGF和VEGF mRNA的表达，在原始卵泡和初级卵泡的颗粒细胞中VEGF的表达量很少，伴随卵泡的发育，颗粒细胞中VEGF的表达明显逐渐增强。本课题组的前期研究也发现VEGF能有效促进绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育，同时证实了VEGF是通过与其两个受体Flt-1（The fms-like tyrosine kinase 1）和KDR/Flk-1（Kinase insert domain receptor/F1k-1）相结合而发挥其生物学效益，且伴随VEGF的外源添加各自表达量有所变化；以此推断VEGF是通过卵母细胞和颗粒细胞同时存在的自分泌和旁分泌的方式促進绵羊卵母细胞成熟过程中α-tubulin和皮质颗粒的时空迁移与重新分布，从而起到促进卵母细胞成熟的作用，进而为后期的胚胎发育打下良好基础（曹忻等，2008，2010；Luo et al.，2008；Cao et al.，2009）。目前，至少有3种VEGF受体被鉴定，分别是VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）和VEGFR-3（Flt-4）。Flt-1和KDR/
Flk-1是VEGF的高亲和力受体（de Vries et al.，1992），对于VEGF生物学反应而言，与受体间的结合作用至关重要。胚胎期所有内皮细胞表达Flt-1和KDR/Flk-1，两者是胚胎期血管系统发生所必须的（Barleon et al.，1996）。【本研究切入点】RNA干扰（Interference RNA，RNAi）因其具有高度的序列特异性和抑制基因表达的高效性，已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域（Herrera-Carrillo and Berkhout，2016；Mathur et al.，2016），但目前国内外对反刍动物VEGF受体基因RNAi的研究报道较少，在绵羊颗粒细胞和卵母细胞成熟、胚胎发育中的研究更少。【拟解决的关键问题】采用电穿孔技术将针对VEGF两个受体Flt-1和KDR/Flk-1的两条有效双链小RNA导入绵羊颗粒细胞内，再用实时荧光定量PCR检测体外培养绵羊颗粒细胞各培养时间VEGF、Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA表达水平的变化，为后期VEGF在绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中信号通路的相关研究打下基础。
1 材料与方法
1. 1 绵羊颗粒细胞采集及体外培养
于新疆石河子市牛羊定点屠宰场采集被屠宰的母羊卵巢，获取带有致密卵丘细胞的复合体，用透明质酸酶将颗粒细胞从卵丘细胞上分离，移除卵母细胞，将含有颗粒细胞的洗卵液2500 r/min离心5 min，弃上清液，加入PBS，吹打混匀后2500 r/min离心5 min，重复两次后转移至含10% FBS的DMEM/F12培养液中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，每天同一时间换1/2液体。每组试验重复3次。
1. 2 siRNA干扰片段信息
针对Flt-1和KDR/Flk-1两个受体基因进行干扰的双链小RNA干扰片段由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成，见表1。
1. 3 siRNA工作液配制
在5.0 nmol的双链siRNA中加入250 μL 1×universal Buffer，得到20 μmol/L的siRNA母液，母液于90 ℃保温2 min，冷却至室温后置于4 ℃备用。
1. 4 电穿孔
采用Amaxa Nucleofector电穿孔仪（Lonza公司）将1 μL 20 μmol/L siRNA母液导入到颗粒细胞内，所导入的细胞分别为对照组（无干扰效果的siRNA片段）、试验组Ⅰ（干扰片段Flt-1-siRNA）、试验组Ⅱ（干扰片段KDR/Flk-1-siRNA）和试验组Ⅲ（干扰片段Flt-1-siRNA和KDR/Flk-1-siRNA）。96孔板37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。
1. 5 RNA提取与cDNA合成
采用FastLine Cell cDNA kit试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，对颗粒细胞进行RNA提取及cDNA第一链合成。
1. 6 实时荧光定量PCR
针对NCBI提供的mRNA序列，采用Primer 5.0及在线BLAST软件设计引物，GAPDH为内参。GAPDH（119 bp）上游5'-CCTGCCAAGTATGATGAGAT-3'，下游5'-TGAGTGTCGCTGTTGAAGT-3'；Flt-1（114 bp）上游5'-TGGCACAAAGACCCAAAAGA-3'，下游5'-GG CGTTGAGCGGAATGTAG-3'； KDR/Flk-1（110 bp）上游5'-CCCCTGATTACACCACACCA-3'，下游5'-CAGA
TTTCCCAGATGCTCCAC-3'；VEGF（340 bp）上游5'-
TGCTCTCTTGGGTACATTGG-3'，下游5'-CCTATGT
GCTGGCTTTGGTG-3'，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
采用罗氏480II实时荧光定量PCR仪进行实时定量PCR扩增。PCR反应体系为Light Cycle 480 SYBR Green I Master 96模块标准反应体系，PCR扩增条件为Light Cycle 480 SYBR Green I Master 96模块标准扩增条件（退火温度60 ℃）。mRNA相对表达量采用2-△△Ct进行计算。
1. 7 统计分析
试验数据采用SPSS 22.0进行单因素方差分析和多重比较。
2 结果与分析
2. 1 VEGF mRNA相对表达量的变化
从表2可看出，绵羊颗粒细胞体外培养第1 d时，试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组Ⅲ的VEGF mRNA相对表达量分别为2.62×10-2、3.54×10-2和2.94×10-2，均极显著高于对照组（P<0.01，下同）。在绵羊颗粒细胞体外培养过程中，试验组Ⅲ的VEGF mRNA相对表达量基本高于试验组Ⅰ和试验组Ⅱ。从培养第2 d开始，各试验组VEGF mRNA相对表达量均降低，到第6 d时与对照组基本保持一致，之后趋于稳定。
3 讨论
卵母细胞和颗粒细胞间存在一种相互依存的关系。卵母细胞的发育需要特异性地与颗粒细胞接触，而颗粒细胞也能通过间隙连接为卵母细胞成熟提供所需营养，以调控卵母细胞发育。体外培养研究发现，将卵母细胞与颗粒细胞分离培养，卵母细胞不能很好地发育（Cecconi et al.，2004）。在卵泡的发育过程中，卵泡颗粒细胞是部分营养供给部位，同时顆粒细胞是卵泡中VEGF的主要来源（Barboni et al.，2000）。但目前仅针对绵羊颗粒细胞体外培养过程中VEGF有效干扰片段对VEGF与其两个受体Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA影响的相关报道甚少。本研究采用电穿孔技术将针对VEGF两个受体的两条有效双链小RNA导入到绵羊颗粒细胞内，该技术不存在RNAi的延迟，较常用的脂质体转染法更加快速有效、便于操作，并有效降低试验成本。
1992年，de Vries等、Terman等分别证明了Flt-1和KDR/Flk-1是VEGF的特异受体。正常组织中的血管内皮细胞中均有Flt-1和KDR/Flk-1分布。Flt-1与胚胎期内皮细胞形态形成有关，促进VEGF的促细胞移动能力；KDR/Flk-1与胚胎内皮细胞分化有关，其受体调节VEGF促细胞分裂能力，其表达可引起细胞形态改变，并对血管形成起重要调节作用（Barleon et al.，1996）。本研究检测出单独体外培养绵羊颗粒细胞过程中存在VEGF及其两受体Flt-1和KDR/Flk-1的mRNA表达，说明绵羊颗粒细胞在正常情况下分泌的VEGF及其受体可经自分泌或旁分泌途径作用于颗粒细胞的发育，与Einspanier等（1999）发现在牛颗粒细胞中有VEGF的表达结果相同，且Einspanier等（2002）还在牛颗粒细胞表面检测到VEGF受体。本研究结果显示，VEGF mRNA相对表达量基本是Flt-1 mRNA相对表达量的102倍、是KDR/Flk-1 mRNA相对表达量的103倍，推断绵羊颗粒细胞积累是VEGF的一大重要来源，在卵母细胞成熟过程中VEGF可通过颗粒细胞与卵母细胞的间隙链接促进卵母细胞成熟，与Barboni等（2000）在猪卵泡发育过程的发现相一致，即颗粒细胞是卵泡中VEGF的主要来源。两受体Flt-1和KDR/Flk-1的干扰片段无论以单一形式或共同方式导入绵羊颗粒细胞中，VEGF在培养第1 d都有表达量的增加，直到第6 d基本与对照组一致。说明干扰后受体Flt-1和KDR/Flk-1任何一个mRNA表达量的骤降，均能提高VEGF mRNA的表达，可能是因为影响了VEGF与受体的结合效率，造成VEGF转录水平升高，也可能是由于两受体mRNA表达量降低，反而刺激VEGF转录水平升高，致使VEGF的作用通路受到影响，但这种影响在第1 d最显著。该结论充分说明VEGF是通过与两受体Flt-1和KDR/ Flk-1结合调节作用而发挥其生物学效应。
本研究结果表明，Flt-1 mRNA相对表达量基本是KDR/Flk-1 mRNA相对表达量的10倍，说明颗粒细胞体外培养各阶段中Flt-1待转录的mRNA量较KDR/ Flk-1高，推断KDR/Flk-1受体途径与Flt-1受体途径相比，在整个绵羊颗粒细胞体外培养过程中与VEGF结合更充分，从而进一步发挥其生物学效应。当Flt-1干扰片段导入绵羊颗粒细胞中后，KDR/Flk-1 mRNA相对表达量有所下降，但受影响程度远不及Flt-1受KDR/Flk-1干扰片段的影响程度。当KDR/Flk-1干扰片段导入颗粒细胞中，Flt-1 mRNA相对表达量急剧上升，在培养前3 d与VEGF mRNA表达水平相当，甚至在第1 d达到10-1数量级，极显著高于VEGF表达量的10-2数量级。说明KDR/Flk-1调控着Flt-1的表达，可能是KDR/Flk-1对Flt-1存在竞争抑制作用。Flt-1较KDR/Flk-1对KDR/Flk-1干扰片段调控作用的反馈更加敏锐，受影响更大，而KDR/Flk-1 mRNA表达更加稳定。由此推测，在绵羊颗粒细胞体外培养过程中KDR/Flk-1受体途径较Flt-1受体途径发挥更主要的作用。此外，两干扰片段同时导入至颗粒细胞中对Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA的干扰效果显著，但尚未特别影响到VEGF mRNA表达，说明在受体mRNA水平检测不到的情况下，VEGF还能通过自分泌的方式表达。 4 結论
两个有效干扰片段在绵羊颗粒细胞体外培养过程中起到很好的干扰作用，可改变VEGF、Flt-1及KDR mRNA的表达量，进而影响颗粒细胞相关生长信号的传输。
参考文献：
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（責任编辑 罗 丽）
关键词： 血管内皮生长因子（VEGF）；血管内皮生长因子受体；RNA干扰（RNAi）；颗粒细胞；绵羊
中图分类号： S826.92 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0336-05
Abstract：【Objective】The paper studied effects of RNA interference（RNAi） on mRNA expression of vascular endothelial growth factor（VEGF） and its receptors in the process of granule cells cultured in vitro， in order to lay a foundation for research in signaling pathway of VEGF during process of oocyte in vitro maturation and embryonic development. 【Method】This research used electroporation to import two double chain small interfering RNA fragments which were designed for VEGF receptors Flt-1 and KDR/Flk-1 into ovine granule cells， and detected Flt-1 mRNA and KDR/Flk-1 mRNA levels variation of ovine granule cells cultured in vitro at different times by real-time quantitative PCR. The researchers named the groups imported with Flt-1 interference fragment and KDR/Flk-1 interference fragment which were screened out in early experiment as treatment group Ⅰand treatment group Ⅱ respectively， and the group imported with both Flt-1 interference fragment and KDR/Flk-1 interference fragment as treatment group Ⅲ， and the group imported with interference fragment which had no RNAi effect as control group. 【Result】Results indicated that， during the process of ovine granule cells cultured in vitro， mRNA expression level of VEGF was 102 times higher than that of Flt-1 and 103 times higher than that of KDR/Flk-1. On the 1st day， the VEGF mRNA expression levels of treatment group Ⅰ， treatment group Ⅱ and treatment group Ⅲ were 2.62×10-2， 3.54×10-2 and 2.94×10-2 respectively， which were significantly higher than that of control group（P<0.01， the same below）. The expression levels of the three treatment groups reduced since the 2nd day and tended to be similar to that of control group on the 6th day. During the culture process， Flt-1 mRNA level of treatment group Ⅱ dropped from 1.02×10-1（on the 1st day） to 8.99×10-4（on the 7th day）， and it had been significantly higher than that of other groups. Flt-1 mRNA expressions of both treatment group Ⅰ and treatment group Ⅲ could be barely detected， then， as time passing by， they rose and tended to be similar to those of other groups on the 8th day. KDR/Flk-1 mRNA level of treatment group Ⅰ was significantly lower than that of control group since the 1st day. KDR/Flk-1 mRNA in both treatment group Ⅱ and treatment group Ⅲ could be barely detected from the 1st day to the 3rd day， and they rose with time passing by and tended to be similar to those of other groups on the 9th day. 【Conclusion】Two pairs of effective interference fragments have good performance on interfering during the process of ovine granule cells in vitro culture， which results in change of mRNA expression levels of VEGF， Flt-1 and KDR mRNA， and affects transmission of growth signal concerning granule cells. Key words： vascular endothelial growth factor（VEGF）； vascular endothelial growth factor receptor； RNA interference（RNAi）； granule cell； ovine
0 引言
【研究意义】Senger等于1983年在肿瘤细胞分泌物中发现了一种促进内皮细胞增生、迁徙，抑制细胞凋亡，提高血管和微血管对大分子物质通透性的生长因子——血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），目前，关于VEGF的研究多集中在人类医学，尤其是肿瘤方面（Espana-Serrano and Chougule，2016；Schicho et al.，2016；Wang et al.，2016）。在本课题组前期研究基础上推断VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育的促进作用可能与颗粒细胞有关，颗粒细胞可通过间隙连接为卵母细胞的成熟提供有利于其代谢的营养物质。因此，探究VEGF对绵羊颗粒细胞的影响，对后期研究VEGF在绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中的信号通路等具有重要意义。【前人研究进展】Otani等（1999）研究推测VEGF可能以旁分泌的形式影响卵泡内血管通透性和血管发生，并以自分泌的方式作用于颗粒细胞和卵泡膜细胞，从而影响卵泡的生长和卵母细胞的成熟。Eppig（2003）研究表明人类颗粒细胞、卵泡膜细胞和卵丘细胞中有VEGF和VEGF mRNA的表达，在原始卵泡和初级卵泡的颗粒细胞中VEGF的表达量很少，伴随卵泡的发育，颗粒细胞中VEGF的表达明显逐渐增强。本课题组的前期研究也发现VEGF能有效促进绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育，同时证实了VEGF是通过与其两个受体Flt-1（The fms-like tyrosine kinase 1）和KDR/Flk-1（Kinase insert domain receptor/F1k-1）相结合而发挥其生物学效益，且伴随VEGF的外源添加各自表达量有所变化；以此推断VEGF是通过卵母细胞和颗粒细胞同时存在的自分泌和旁分泌的方式促進绵羊卵母细胞成熟过程中α-tubulin和皮质颗粒的时空迁移与重新分布，从而起到促进卵母细胞成熟的作用，进而为后期的胚胎发育打下良好基础（曹忻等，2008，2010；Luo et al.，2008；Cao et al.，2009）。目前，至少有3种VEGF受体被鉴定，分别是VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）和VEGFR-3（Flt-4）。Flt-1和KDR/
Flk-1是VEGF的高亲和力受体（de Vries et al.，1992），对于VEGF生物学反应而言，与受体间的结合作用至关重要。胚胎期所有内皮细胞表达Flt-1和KDR/Flk-1，两者是胚胎期血管系统发生所必须的（Barleon et al.，1996）。【本研究切入点】RNA干扰（Interference RNA，RNAi）因其具有高度的序列特异性和抑制基因表达的高效性，已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域（Herrera-Carrillo and Berkhout，2016；Mathur et al.，2016），但目前国内外对反刍动物VEGF受体基因RNAi的研究报道较少，在绵羊颗粒细胞和卵母细胞成熟、胚胎发育中的研究更少。【拟解决的关键问题】采用电穿孔技术将针对VEGF两个受体Flt-1和KDR/Flk-1的两条有效双链小RNA导入绵羊颗粒细胞内，再用实时荧光定量PCR检测体外培养绵羊颗粒细胞各培养时间VEGF、Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA表达水平的变化，为后期VEGF在绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中信号通路的相关研究打下基础。
1 材料与方法
1. 1 绵羊颗粒细胞采集及体外培养
于新疆石河子市牛羊定点屠宰场采集被屠宰的母羊卵巢，获取带有致密卵丘细胞的复合体，用透明质酸酶将颗粒细胞从卵丘细胞上分离，移除卵母细胞，将含有颗粒细胞的洗卵液2500 r/min离心5 min，弃上清液，加入PBS，吹打混匀后2500 r/min离心5 min，重复两次后转移至含10% FBS的DMEM/F12培养液中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，每天同一时间换1/2液体。每组试验重复3次。
1. 2 siRNA干扰片段信息
针对Flt-1和KDR/Flk-1两个受体基因进行干扰的双链小RNA干扰片段由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成，见表1。
1. 3 siRNA工作液配制
在5.0 nmol的双链siRNA中加入250 μL 1×universal Buffer，得到20 μmol/L的siRNA母液，母液于90 ℃保温2 min，冷却至室温后置于4 ℃备用。
1. 4 电穿孔
采用Amaxa Nucleofector电穿孔仪（Lonza公司）将1 μL 20 μmol/L siRNA母液导入到颗粒细胞内，所导入的细胞分别为对照组（无干扰效果的siRNA片段）、试验组Ⅰ（干扰片段Flt-1-siRNA）、试验组Ⅱ（干扰片段KDR/Flk-1-siRNA）和试验组Ⅲ（干扰片段Flt-1-siRNA和KDR/Flk-1-siRNA）。96孔板37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。
1. 5 RNA提取与cDNA合成
采用FastLine Cell cDNA kit试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，对颗粒细胞进行RNA提取及cDNA第一链合成。
1. 6 实时荧光定量PCR
针对NCBI提供的mRNA序列，采用Primer 5.0及在线BLAST软件设计引物，GAPDH为内参。GAPDH（119 bp）上游5'-CCTGCCAAGTATGATGAGAT-3'，下游5'-TGAGTGTCGCTGTTGAAGT-3'；Flt-1（114 bp）上游5'-TGGCACAAAGACCCAAAAGA-3'，下游5'-GG CGTTGAGCGGAATGTAG-3'； KDR/Flk-1（110 bp）上游5'-CCCCTGATTACACCACACCA-3'，下游5'-CAGA
TTTCCCAGATGCTCCAC-3'；VEGF（340 bp）上游5'-
TGCTCTCTTGGGTACATTGG-3'，下游5'-CCTATGT
GCTGGCTTTGGTG-3'，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
采用罗氏480II实时荧光定量PCR仪进行实时定量PCR扩增。PCR反应体系为Light Cycle 480 SYBR Green I Master 96模块标准反应体系，PCR扩增条件为Light Cycle 480 SYBR Green I Master 96模块标准扩增条件（退火温度60 ℃）。mRNA相对表达量采用2-△△Ct进行计算。
1. 7 统计分析
试验数据采用SPSS 22.0进行单因素方差分析和多重比较。
2 结果与分析
2. 1 VEGF mRNA相对表达量的变化
从表2可看出，绵羊颗粒细胞体外培养第1 d时，试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组Ⅲ的VEGF mRNA相对表达量分别为2.62×10-2、3.54×10-2和2.94×10-2，均极显著高于对照组（P<0.01，下同）。在绵羊颗粒细胞体外培养过程中，试验组Ⅲ的VEGF mRNA相对表达量基本高于试验组Ⅰ和试验组Ⅱ。从培养第2 d开始，各试验组VEGF mRNA相对表达量均降低，到第6 d时与对照组基本保持一致，之后趋于稳定。
3 讨论
卵母细胞和颗粒细胞间存在一种相互依存的关系。卵母细胞的发育需要特异性地与颗粒细胞接触，而颗粒细胞也能通过间隙连接为卵母细胞成熟提供所需营养，以调控卵母细胞发育。体外培养研究发现，将卵母细胞与颗粒细胞分离培养，卵母细胞不能很好地发育（Cecconi et al.，2004）。在卵泡的发育过程中，卵泡颗粒细胞是部分营养供给部位，同时顆粒细胞是卵泡中VEGF的主要来源（Barboni et al.，2000）。但目前仅针对绵羊颗粒细胞体外培养过程中VEGF有效干扰片段对VEGF与其两个受体Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA影响的相关报道甚少。本研究采用电穿孔技术将针对VEGF两个受体的两条有效双链小RNA导入到绵羊颗粒细胞内，该技术不存在RNAi的延迟，较常用的脂质体转染法更加快速有效、便于操作，并有效降低试验成本。
1992年，de Vries等、Terman等分别证明了Flt-1和KDR/Flk-1是VEGF的特异受体。正常组织中的血管内皮细胞中均有Flt-1和KDR/Flk-1分布。Flt-1与胚胎期内皮细胞形态形成有关，促进VEGF的促细胞移动能力；KDR/Flk-1与胚胎内皮细胞分化有关，其受体调节VEGF促细胞分裂能力，其表达可引起细胞形态改变，并对血管形成起重要调节作用（Barleon et al.，1996）。本研究检测出单独体外培养绵羊颗粒细胞过程中存在VEGF及其两受体Flt-1和KDR/Flk-1的mRNA表达，说明绵羊颗粒细胞在正常情况下分泌的VEGF及其受体可经自分泌或旁分泌途径作用于颗粒细胞的发育，与Einspanier等（1999）发现在牛颗粒细胞中有VEGF的表达结果相同，且Einspanier等（2002）还在牛颗粒细胞表面检测到VEGF受体。本研究结果显示，VEGF mRNA相对表达量基本是Flt-1 mRNA相对表达量的102倍、是KDR/Flk-1 mRNA相对表达量的103倍，推断绵羊颗粒细胞积累是VEGF的一大重要来源，在卵母细胞成熟过程中VEGF可通过颗粒细胞与卵母细胞的间隙链接促进卵母细胞成熟，与Barboni等（2000）在猪卵泡发育过程的发现相一致，即颗粒细胞是卵泡中VEGF的主要来源。两受体Flt-1和KDR/Flk-1的干扰片段无论以单一形式或共同方式导入绵羊颗粒细胞中，VEGF在培养第1 d都有表达量的增加，直到第6 d基本与对照组一致。说明干扰后受体Flt-1和KDR/Flk-1任何一个mRNA表达量的骤降，均能提高VEGF mRNA的表达，可能是因为影响了VEGF与受体的结合效率，造成VEGF转录水平升高，也可能是由于两受体mRNA表达量降低，反而刺激VEGF转录水平升高，致使VEGF的作用通路受到影响，但这种影响在第1 d最显著。该结论充分说明VEGF是通过与两受体Flt-1和KDR/ Flk-1结合调节作用而发挥其生物学效应。
本研究结果表明，Flt-1 mRNA相对表达量基本是KDR/Flk-1 mRNA相对表达量的10倍，说明颗粒细胞体外培养各阶段中Flt-1待转录的mRNA量较KDR/ Flk-1高，推断KDR/Flk-1受体途径与Flt-1受体途径相比，在整个绵羊颗粒细胞体外培养过程中与VEGF结合更充分，从而进一步发挥其生物学效应。当Flt-1干扰片段导入绵羊颗粒细胞中后，KDR/Flk-1 mRNA相对表达量有所下降，但受影响程度远不及Flt-1受KDR/Flk-1干扰片段的影响程度。当KDR/Flk-1干扰片段导入颗粒细胞中，Flt-1 mRNA相对表达量急剧上升，在培养前3 d与VEGF mRNA表达水平相当，甚至在第1 d达到10-1数量级，极显著高于VEGF表达量的10-2数量级。说明KDR/Flk-1调控着Flt-1的表达，可能是KDR/Flk-1对Flt-1存在竞争抑制作用。Flt-1较KDR/Flk-1对KDR/Flk-1干扰片段调控作用的反馈更加敏锐，受影响更大，而KDR/Flk-1 mRNA表达更加稳定。由此推测，在绵羊颗粒细胞体外培养过程中KDR/Flk-1受体途径较Flt-1受体途径发挥更主要的作用。此外，两干扰片段同时导入至颗粒细胞中对Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA的干扰效果显著，但尚未特别影响到VEGF mRNA表达，说明在受体mRNA水平检测不到的情况下，VEGF还能通过自分泌的方式表达。 4 結论
两个有效干扰片段在绵羊颗粒细胞体外培养过程中起到很好的干扰作用，可改变VEGF、Flt-1及KDR mRNA的表达量，进而影响颗粒细胞相关生长信号的传输。
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（責任编辑 罗 丽）