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摘要：【目的】克隆水稻黄嘌呤脱氢酶（Xanthine dehydrogenase，XDH）基因（OsXDH），分析其生物信息学特性及表达特性，为研究XDH在水稻生长发育和响应逆境胁迫中的调控机制提供理论依据。【方法】以粳稻品种日本晴为材料，采用同源克隆技术克隆OsXDH基因，应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析。利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测OsXD14基因的组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况，并对不同转基因株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析。【结果】克隆获得OsXDH基因的开放阅读框序列（ORF）（GenBankg登录号LOC4333171），其长度为4110 bp，编码1369个氨基酸。OsXDH蛋白分子量大小为150.23 kD，理论等电点（pI）为6.54，与小麦、高粱、玉米、谷子和油菜等作物XDH蛋白氨基酸序列的相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%，表明XDH蛋白氨基酸序列具有高度保守性。OsXDH基因在水稻不同组织部位均有表达，灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期（P<0.05），且受干旱、黑暗、高温和盐胁迫诱导高效表达。OsXDH过表达水稻转基因株系乳熟期剑叶的XDH活性和叶绿素含量高于野生型，OsXDH干扰转基因株系的XDH活性和叶绿素含量低于野生型。【结论】OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达，推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因。
关键词：水稻；OsXDH基因；基因克隆；生物信息学；表达分析；胁迫
中图分类号：S511.03 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）12-2113-09
0引言
【研究意义】由于生态环境不断恶化，干旱、盐碱、极端温度及重金属污染等严重影响粮食作物的产量和品质。作物抗性是由多基因控制的数量性状，抗性基因克隆和功能分析已成为研究热点。黄嘌呤脱氢酶（Xanthine dehvdrogenase，XDH）作为调控嘌呤代谢的中间酶类，能将黄嘌呤和次黄嘌呤催化生成尿酸，经一系列代谢反应，最终生成酰脲类物质（Ureides），在应答生物胁迫与非生物胁迫中发挥重要作用（Montalbini，2000；Aguey-Zinsou et al.，2003；Zdunek-zastocka and Lips，2003；Taylor and Cowan，2004；Zrenner et al.，2006；Brychkova et al.，2008a）。因此，克隆水稻XDH基因（OsXDH），分析其序列特征，可为阐明植物XDH的抗逆境胁迫调控机制提供理论参考。【前人研究进展】目前，已对不同植物XDH的抗逆境胁迫调控机制开展了大量研究，结果均表明XDH对逆境胁迫有应答响应，与植物体内的多个生理代谢相关（Aguey-Zinsou et al.，2003；Taylorand Cowan，2004；Nakagawa et al.，2007），如Montal-bini（1991）研究发现，感染锈病的豆科植物叶片中嘌呤分解代谢加快，酰脲类物质含量快速积累，对非共生病原的抗性增强。植物抗性增强的原因是嘌呤代谢产物酰脲类物质具有较高的碳氮比，易于在植物体内转运，是氮素贮存和低耗转运载体，可降低氮素转运过程中的能量损耗，以提高植物在逆境胁迫下的生存能力（Buchanan-Wollaston，1997；Gepstein，2004），因此，植物体内的XDH活性随着盐和NH4浓度的增加而升高，且氨态氮处理下XDH活性高于硝态氮处理（Barabfis et al.，2000；Zrenner et al.，2006；Zdunek-zastocka and Lips，2003）。也有研究表明，酰脲类物质可清除植物体内H2O2、O2等活性氧自由基（Becker et al.，1989；Pastori and del Rio，1997），增加尿囊素和尿囊酸含量，從而降低氧化性损伤和减少幼苗死亡（Brychkova et al.，2008b）。当植物受干旱、盐胁迫和黑暗胁迫时，XDH活性升高，尿酸和酰脲类物质含量增加，体内活性氧含量降低，促使植株对环境胁迫的耐受能力增强，其病死率明显降低（Brychkova et al.，2008b；Watanabe et al.，2010；Maet al.，2016；Hofinann，2016；You et al.，2017）。但钼素缺失会阻碍黄嘌呤分解代谢，不利于氮素在植株体内的运输，导致植株长势变弱（孙学成和胡承孝，2005）。此外，有研究表明XDH蛋白结构的发生改变可介导细胞分裂素、脱落酸和生长素等植物激素的动态平衡，发挥对植物性状及抗逆境胁迫的调控作用（Leydecker et al.，1995；Taylor and Cowan，2001；Smith and Atkins，2004；Watanabe et al.，2014）。【本研究切入点】至今鲜见有关水稻OsXDH基因克隆并分析其在非生物胁迫下表达特性的研究报道。【拟解决的关键问题】利用同源克隆技术克隆水稻OsXDH基因的开放阅读框序列（ORF），采用生物信息学软件分析其序列结构特征，并用实时荧光定量PCR（qPCR）检测其组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况，同时比较不同OsXDH转基因水稻株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性及叶绿素含量的差异，为研究XDH对水稻品种生长发育及响应逆境胁迫的调控机理提供理论参考。
1材料与方法
1.1试验材料
供试的粳稻品种为日本晴（Oryza sativa L.spp.japonica cv.Nipponbare），其野生型、OsXDH干扰转基因株系（Ri3、Ri5和Ri6）及过表达转基因株系（OEl、OE3和OE9）均由江西省作物生理生态与遗传育种重点实验室提供。主要试剂：KOD FX高保真PCR酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，Mini-BEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒、PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，其他生化试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要设备仪器：人工气候箱（GXZ智能型，宁波江南仪器厂）、ChemiDoc XRS+凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）、NanoDrop ND2000超微量核酸蛋白分析仪（Thermo，美国）、CFX96 Real-Time PCR Detection System（B10-RAD，美国）、TU-1810紫外可见分光光度计（普析通用，北京）和电泳转印系统（BIO-RAD，美国）。 1.2胁迫处理及样品采集
干旱胁迫处理采用土培法，高温、黑暗和盐胁迫处理均采用水培法。所有处理均在人工气候箱中进行，正常生长条件参数：12 h/12 h（白天/黑夜）、28℃/25℃（白天/黑夜）、光照强度为20000 lx/0 lX（白天/黑夜）和75%相对湿度。水稻幼苗在正常条件下生长N4.5叶期，选取长势基本一致的植株进行胁迫处理。干旱胁迫处理：施用30%PEG-6000溶液进行模拟干旱胁迫处理，胁迫时间为4 d。高温胁迫处理：处理期间将人工气候箱温度调至42℃/42℃（白天/黑夜），其他参数不变，胁迫时间为5 d。黑暗胁迫处理：处理期间将人工气候箱光照调至0 lx/0 lX（白天/黑夜），其他参数不变，胁迫时间为6 d；盐胁迫處理：在营养液中添加200 mmol/L NaCl，胁迫时间为3 d，胁迫处理后，更换为正常的水培营养液。每处理均在胁迫处理前、胁迫处理后及恢复生长7 d后采集主茎最上部完全展开叶，液氮速冻后，于80℃保存，用于不同逆境胁迫下OsXDH基因的表达特性分析。
将日本晴的野生型、OsXDHtz扰转基因株系及过表达转基因株系种植于江西农业大学实验田，采集野生型苗期（4.5叶期）的叶（主茎最上部叶）、茎、根及分蘖盛期和灌浆期主茎最上部叶，液氮速冻后，于-80℃保存，用于qPCR检测不同组织及不同生育期OsXDH～因的表达情况；采集野生型、OsXDH干扰转基因株系及过表达转基因株系乳熟期剑叶，液氮速冻后，于-80℃保存，用于OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量测定。
1.3总RNA提取及cDNA第一链合成
按照RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒说明提取水稻叶片总RNA，利用NanoDrop ND2000超微量核酸蛋白分析仪对其浓度和质量进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。以提取的总RNA为模板，按照PrimeScriptTM 1stStand cDNA Syn-thesis Kit说明反转录合成cDNA第一链。
1.4引物设计及合成
根据拟南芥AtXDH1基因序列在NCBI数据库中进行BLAST检索，发现在水稻基因组数据库中存在相似度较高的转录本（OSJNBa0091822.11），被诠释为Xanthine dehydrogenase。根据NCBI数据库中AtXDH1基因的cDNA序列，利用Primer 5.0设计引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.5基因克隆
以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系50.0μL：2xPCR Buffer for KOD FX 25.0μL，2 mmol/LdNTPs 10.0μL，10μmol/L正、反向引物（ORF-F和ORF-R）各1.5μL，cDNA模板2.0μL，1.0 U/μL KODFX 1.0μL，ddH2O补足N50.0μL。扩增程序：94℃预变性2.0 min；98℃10 s，58℃30 s，68℃5 min，进行35个循环；68℃延伸10.0 min，4℃保存。取10.0μL PCR产物用于1%琼脂糖凝胶电泳检测，其余送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.6生物信息学分析
利用NCBI数据库进行BLAST同源比对分析，利用ORF Finder寻找基因序列的编码框，利用Prot-Param和Smart进行蛋白的理论性质和保守结构域预测，利用NetPhos 3.1 Server和DictyOGlvc 1.1 Server预测氨基酸序列磷酸化及O-糖基化修饰情况，利用ProtScale分析蛋白质的疏水性，利用SignalP1.1Server、TMHMM Sever 2.0和PSORT II预测蛋白的信号肽和亚细胞定位预测，运用SOPMA预测蛋白的二级结构，使用DNAMAN进行氨基酸序列比对及聚类分析。
1.7 qPCR检测
利用SYBR*Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒在CFX96Real-Time PCR Detection System上进行qPCR检测，内参基因为Ubq-real，其引物序列（Ubq-real-F和Ubq-real-R）见表1。反应体系25.0μL：SYBR Pre-mix Ex Taq Ⅱ 12.5μL，正、反向引物（qPCR-F和qPCR-R）各1.0μL，DNA模板（<100 ng）2.0μL，ddI-120补足至25.0μL。扩增程序：95℃预变性30 s；95℃5 s，60℃30 s，进行40个循环。利用Bio-Rad CFX Manager 2.1数据分析模块分析OsXDH基因的表达丰度。
1.8 XDH活性测定
称取0.2 g去除叶脉的水稻剑叶碎片，液氮研磨2～3次后加入800.0μL蛋白提取液研磨至糊状；将研磨液移入2 mL离心管，4℃下14000 r/min离心20 min后取上清液，65℃水浴90 s变性，再离心取上清液；取10μL上清液放入5 mL离心管中，加入490.0μLddH2O和4.5 mL考马斯亮蓝溶液混匀，于595 nm波长下测定OD值。利用牛血清蛋白制作标准曲线，测定可溶性蛋白含量，并进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量为50 ug，时长为4 h，将胶片放至以次黄嘌呤为底物和以氮蓝四唑为显色剂的混合溶液中，暗处20 min，用冰醋酸清洗后成像（Sagiet al.，1998）。
1.9叶绿素含量测定
参照Lichtenthaler和Wellbuen（1983）的方法，用80%丙酮溶液提取水稻叶片叶绿素，并用分光光度法测定其含量。
1.10统计分析 试验数据采用Excel 2007进行整理作图；利用SPSS 22.0进行显著性分析（One-way ANOVA）。
2结果与分析
2.1 OsXDH基因cDNA编码区的克隆结果
以反转录合成的cDNA为模板，以CDS-F和CDS-R为引物，PCR扩增获得目的片段。结果如图1所示，目的片段约4500 bp，与预期结果相符。测序结果显示，克隆获得的OsXDH基因序列长度为4316bp，其开放阅读框（ORF）长度为4110 bp，编码1369个氨基酸（图2）。将OsXDH基因序列提交至Gen-Bank，登录号LOC4333171。OsXDH基因与基因组DNA序列的比对结果显示，该基因含有14个外显子和13个内含子。
2.2 0sXDH蛋白的生物信息学分析结果
2.2.1理化性质 OsXDH蛋白的理化性质预测结果显示，其分子式为C6713H10509N182501976857，分子量为150.23 kD，理论等电点（pI）为6.54；丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸和缬氨酸个数分别占0sXDH蛋白氨基酸总数的8.0%、8.2%、8.6%和7.7%，不含蛋氨酸和含硒半胱氨酸；不稳定指数为38.87，表明其为稳定蛋白。
2.2.2保守结构域 OsXDH蛋白不仅存在1个CO_deh_flav_C结构域（455～561 aa），可与钼结合形成钼辅因子，构成XDH底物的结合部位和氧化还原部位，还存在1个进化保守的蛋白结构域Aid Xandh C（620～727 aa），此结构域仅存在于醛氧化酶和黄嘌呤脱氢酶中，由此推测黄嘌呤脱氢酶与醛氧化酶具有相似的功能，均可参与植物对非生物胁迫的响应。
2.2.3蛋白磷酸化和糖基化位点 氨基酸残基的磷酸化和糖基化可调节蛋白的活性和功能。0sXDH蛋白氨基酸序列中发生磷酸化修饰的位点有131个，其中色氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化修饰位点分别有71、45和15个（图3）；发生O-糖基化修饰的位点仅1个（图4）。通过预测磷酸化与O-糖基化修饰位点，为黄嘌呤脱氢酶翻译后修饰调控研究提供参考。
2.2.4信号肽及亚细胞定位 信号肽预测结果显示，OsXDH蛋白信号肽平均值为0.106（<0.500），推测其为非分泌蛋白，在细胞质中合成后不被转运。利用TargetP 1.1 Server预测发现OsXDH蛋白广泛位于细胞内（除叶绿体和线粒体外），而pSORTⅡ预测其位于叶绿体中，存在明显分歧，因此，其实际位置需利用免疫荧光、GFP融合表达等技术进一步确认。
2.2.5二级结构 OsXDH蛋白的二级结构中，无规则卷曲（Random coil，C）占35.43%，α-螺旋（α-he-liX，H）占31.56%，延伸链（Extended strand，E）占22.86%，β-转角（β-turn，t）占10.15%。如图5所示，4种二级结构分布较均匀。
2.2.6 亲/疏水性 蛋白的亲/疏水性有助于提高其稳定性及多样性，与其结构和功能密切相关。由图6可知，0sXDH蛋白疏水性最强的位点为第1314位，分值2.389；亲水性最强的位点为第1029位，分值-3.589，亲水性平均值为-0.098，由此推测0sXDH为亲水性蛋白。
2.2.7同源比对及系统发育进化树分析 从NCBI数据库筛选获得5种作物的XDH蛋白氨基酸序列，并与OsXDH蛋白的氨基酸序列进行比对，结果显示OsXDH蛋白的氨基酸序列与高粱（Sorghum bico-lot）、谷子（Setaria italica）、小麦（Aegilops tauschii）、玉米（Zea mays）和油菜（Brassica napus）XDH氨基酸序列相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%（图7）。系统发育进化树分析结果表明，单子叶植物和双子叶植物XDH蛋白同系物分别聚在两个不同的分支，表明XDH蛋白在单子叶植物和双子叶植物间存在一定的分化，但XDH蛋白在同种属间保守性较高，如水稻与小麦、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、谷子和高粱同属一个小分支，均为禾本科植物，XDH蛋白具有较高的同源性；虽然玉米同属禾本科植物，但与芦笋、油棕、芭蕉和蝴蝶兰分属于单子叶植物的另一分支群（图8），其原因可能与物种起源地环境有关，玉米、芦笋、油棕、芭蕉和蝴蝶兰均起源于热带或亚热带地区。综上所述，植物中XDH蛋白的氨基酸序列具有高度保守性，水稻OsXDH蛋白与小麦、二穗短柄草的XDH蛋白分子进化距离最小，亲缘关系最近。
2.3 OsXDH基因表达特性分析结果
2.3.1 OsXDH基因组织表达特性 从图9-A可知，苗期OsXDH基因在水稻根、茎和叶（主茎最上部叶）中的表达量无显著差异（P<0.05，下同）。从图9-B可知，苗期和分蘖盛期OsXDH基因在水稻主茎最上部叶片的表达量无显著差异，但灌浆期OsXDH基因的表达量显著高于苗期和分蘖盛期，由此推测OsXDH基因为特异性表达，参与水稻生长发育相关的分子调控。
2.3.2不同胁迫下OsXDH基因的表达情况 由图10可知，不同胁迫处理均可诱导水稻OsXDH基因上调表达，其中干旱、黑暗和高温胁迫处理后OsXDH基因的表达量均显著高于胁迫处理前，恢复生长7 d后其表达量显著降低，但仍显著高于胁迫处理前，尤其是干旱和高温胁迫处理后OsXDH基因的表达量增至胁迫处理前的2.5倍。盐胁迫处理后OsXDH基因的表达量显著高于胁迫处理前，恢复生长7 d后其表达量显著降低，但与胁迫处理前无显著差异。可见，OsXDH基因的表达受到逆境胁迫因子诱导高效表达，参与逆境胁迫响应。
2.4 OsXDH基因表达量对水稻乳熟期生理指标的影响
对野生型、OsXDH干扰转基因株系及过表达转基因株系乳熟期剑叶的OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析，结果表明，OsXDH干扰转基因株系的OsXDH基因表达量均显著低于野生型和OsXDH过表达转基因株系，OsXDH过表达转基因株系的OsXDH基因表达量均显著高于野生型（图11-A）；OsXDH干扰转基因株系XDH活性低于野生型，而OsXDH过表达转基因株系高于野生型（图11-B）；OsXDH干扰转基因株系的叶绿素含量显著低于野生型和OsXDH过表达转基因株系，OsXDH过表达转基因株系的叶绿素含量高于野生型，但未达显著水平（圖11-C）。表明OsXDH基因表达量、XDH活性与叶绿素含量呈正相关，结合水稻不同生育时期OsXDH基因的表达特性，推测OsXDH基因参与调控水稻生育后期的生长发育。 3讨论
本研究从粳稻品种日本晴中克隆获得OsXDH基因ORF序列，长度为4110 bp，编码1369个氨基酸。已有研究表明，拟南芥和兰科植物的XDH基因均属于核基因（Xiong et al.，2001；Hesberg et al.，2004；G6miak et al.，2010），但本研究中不同生物信息学软件对OsXDH蛋白亚细胞定位结果不同，故未能明确其位置，需利用免疫荧光、GFP融合表达等技术进行蛋白亚细胞定位。此外，本研究通过同源比对及聚类分析，发现水稻OsXDH蛋白的氨基酸序列与单子叶作物高粱、小米和小麦的同源性较高，均在80.00%以上，虽然单子叶与双子叶植物分属不同分支，但其同源性仍在70.00%以上，证明不同植物中XDH蛋白的氨基酸序列具有高度的保守性，推測其在不同植物中发挥相似的生理功能。
本研究发现OsXDH基因在不同组织及不同生育期均有表达，但其在水稻灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期，表明OsXDH基因为特异性表达。同时本研究发现，在干旱、黑暗、高温和盐胁迫下，OsXDH基因表达量显著上调，尤其在干旱和高温胁迫下其增至胁迫处理前的2.5倍，推测水稻OsX-DH基因参与逆境胁迫响应。这与Hesberg等（2004）研究发现拟南芥中AtXDH1基因受不同逆境胁迫因子诱导均表达上调的结论一致。说明不同植物中的XDH基因具有相似表达调控功能。
本研究利用OsXDH干扰转基因株系和过表达转基因株系，对OsXDH基因的功能进行初步鉴定，结果显示，OsXDH干扰转基因株系中的XDH活性和叶绿素含量低于野生型，而OsXDH过表达转基因株系的XDH活性和叶绿素含量均高于野生型，表明通过调控OsXDH基因的表达水平可调节水稻XDH活性，从而调控水稻的生长发育，与前人在拟南芥中的研究结果（Nakagawa et al.，2007；Watanabe et al.，2010；Zarepour et al.，2010；Watanabe et al.，2014）一致。由此推测OsXDH基因参与调控水稻生育后期的生长发育。在今后的研究中，可利用OsXDH～-扰转基因株系和过表达转基因株系进一步研究OsX-DH基因水稻在生长发育及逆境胁迫应答过程中的调控机制。
4结论
OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达，推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因。
关键词：水稻；OsXDH基因；基因克隆；生物信息学；表达分析；胁迫
中图分类号：S511.03 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）12-2113-09
0引言
【研究意义】由于生态环境不断恶化，干旱、盐碱、极端温度及重金属污染等严重影响粮食作物的产量和品质。作物抗性是由多基因控制的数量性状，抗性基因克隆和功能分析已成为研究热点。黄嘌呤脱氢酶（Xanthine dehvdrogenase，XDH）作为调控嘌呤代谢的中间酶类，能将黄嘌呤和次黄嘌呤催化生成尿酸，经一系列代谢反应，最终生成酰脲类物质（Ureides），在应答生物胁迫与非生物胁迫中发挥重要作用（Montalbini，2000；Aguey-Zinsou et al.，2003；Zdunek-zastocka and Lips，2003；Taylor and Cowan，2004；Zrenner et al.，2006；Brychkova et al.，2008a）。因此，克隆水稻XDH基因（OsXDH），分析其序列特征，可为阐明植物XDH的抗逆境胁迫调控机制提供理论参考。【前人研究进展】目前，已对不同植物XDH的抗逆境胁迫调控机制开展了大量研究，结果均表明XDH对逆境胁迫有应答响应，与植物体内的多个生理代谢相关（Aguey-Zinsou et al.，2003；Taylorand Cowan，2004；Nakagawa et al.，2007），如Montal-bini（1991）研究发现，感染锈病的豆科植物叶片中嘌呤分解代谢加快，酰脲类物质含量快速积累，对非共生病原的抗性增强。植物抗性增强的原因是嘌呤代谢产物酰脲类物质具有较高的碳氮比，易于在植物体内转运，是氮素贮存和低耗转运载体，可降低氮素转运过程中的能量损耗，以提高植物在逆境胁迫下的生存能力（Buchanan-Wollaston，1997；Gepstein，2004），因此，植物体内的XDH活性随着盐和NH4浓度的增加而升高，且氨态氮处理下XDH活性高于硝态氮处理（Barabfis et al.，2000；Zrenner et al.，2006；Zdunek-zastocka and Lips，2003）。也有研究表明，酰脲类物质可清除植物体内H2O2、O2等活性氧自由基（Becker et al.，1989；Pastori and del Rio，1997），增加尿囊素和尿囊酸含量，從而降低氧化性损伤和减少幼苗死亡（Brychkova et al.，2008b）。当植物受干旱、盐胁迫和黑暗胁迫时，XDH活性升高，尿酸和酰脲类物质含量增加，体内活性氧含量降低，促使植株对环境胁迫的耐受能力增强，其病死率明显降低（Brychkova et al.，2008b；Watanabe et al.，2010；Maet al.，2016；Hofinann，2016；You et al.，2017）。但钼素缺失会阻碍黄嘌呤分解代谢，不利于氮素在植株体内的运输，导致植株长势变弱（孙学成和胡承孝，2005）。此外，有研究表明XDH蛋白结构的发生改变可介导细胞分裂素、脱落酸和生长素等植物激素的动态平衡，发挥对植物性状及抗逆境胁迫的调控作用（Leydecker et al.，1995；Taylor and Cowan，2001；Smith and Atkins，2004；Watanabe et al.，2014）。【本研究切入点】至今鲜见有关水稻OsXDH基因克隆并分析其在非生物胁迫下表达特性的研究报道。【拟解决的关键问题】利用同源克隆技术克隆水稻OsXDH基因的开放阅读框序列（ORF），采用生物信息学软件分析其序列结构特征，并用实时荧光定量PCR（qPCR）检测其组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况，同时比较不同OsXDH转基因水稻株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性及叶绿素含量的差异，为研究XDH对水稻品种生长发育及响应逆境胁迫的调控机理提供理论参考。
1材料与方法
1.1试验材料
供试的粳稻品种为日本晴（Oryza sativa L.spp.japonica cv.Nipponbare），其野生型、OsXDH干扰转基因株系（Ri3、Ri5和Ri6）及过表达转基因株系（OEl、OE3和OE9）均由江西省作物生理生态与遗传育种重点实验室提供。主要试剂：KOD FX高保真PCR酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，Mini-BEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒、PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，其他生化试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要设备仪器：人工气候箱（GXZ智能型，宁波江南仪器厂）、ChemiDoc XRS+凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）、NanoDrop ND2000超微量核酸蛋白分析仪（Thermo，美国）、CFX96 Real-Time PCR Detection System（B10-RAD，美国）、TU-1810紫外可见分光光度计（普析通用，北京）和电泳转印系统（BIO-RAD，美国）。 1.2胁迫处理及样品采集
干旱胁迫处理采用土培法，高温、黑暗和盐胁迫处理均采用水培法。所有处理均在人工气候箱中进行，正常生长条件参数：12 h/12 h（白天/黑夜）、28℃/25℃（白天/黑夜）、光照强度为20000 lx/0 lX（白天/黑夜）和75%相对湿度。水稻幼苗在正常条件下生长N4.5叶期，选取长势基本一致的植株进行胁迫处理。干旱胁迫处理：施用30%PEG-6000溶液进行模拟干旱胁迫处理，胁迫时间为4 d。高温胁迫处理：处理期间将人工气候箱温度调至42℃/42℃（白天/黑夜），其他参数不变，胁迫时间为5 d。黑暗胁迫处理：处理期间将人工气候箱光照调至0 lx/0 lX（白天/黑夜），其他参数不变，胁迫时间为6 d；盐胁迫處理：在营养液中添加200 mmol/L NaCl，胁迫时间为3 d，胁迫处理后，更换为正常的水培营养液。每处理均在胁迫处理前、胁迫处理后及恢复生长7 d后采集主茎最上部完全展开叶，液氮速冻后，于80℃保存，用于不同逆境胁迫下OsXDH基因的表达特性分析。
将日本晴的野生型、OsXDHtz扰转基因株系及过表达转基因株系种植于江西农业大学实验田，采集野生型苗期（4.5叶期）的叶（主茎最上部叶）、茎、根及分蘖盛期和灌浆期主茎最上部叶，液氮速冻后，于-80℃保存，用于qPCR检测不同组织及不同生育期OsXDH～因的表达情况；采集野生型、OsXDH干扰转基因株系及过表达转基因株系乳熟期剑叶，液氮速冻后，于-80℃保存，用于OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量测定。
1.3总RNA提取及cDNA第一链合成
按照RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒说明提取水稻叶片总RNA，利用NanoDrop ND2000超微量核酸蛋白分析仪对其浓度和质量进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。以提取的总RNA为模板，按照PrimeScriptTM 1stStand cDNA Syn-thesis Kit说明反转录合成cDNA第一链。
1.4引物设计及合成
根据拟南芥AtXDH1基因序列在NCBI数据库中进行BLAST检索，发现在水稻基因组数据库中存在相似度较高的转录本（OSJNBa0091822.11），被诠释为Xanthine dehydrogenase。根据NCBI数据库中AtXDH1基因的cDNA序列，利用Primer 5.0设计引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.5基因克隆
以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系50.0μL：2xPCR Buffer for KOD FX 25.0μL，2 mmol/LdNTPs 10.0μL，10μmol/L正、反向引物（ORF-F和ORF-R）各1.5μL，cDNA模板2.0μL，1.0 U/μL KODFX 1.0μL，ddH2O补足N50.0μL。扩增程序：94℃预变性2.0 min；98℃10 s，58℃30 s，68℃5 min，进行35个循环；68℃延伸10.0 min，4℃保存。取10.0μL PCR产物用于1%琼脂糖凝胶电泳检测，其余送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.6生物信息学分析
利用NCBI数据库进行BLAST同源比对分析，利用ORF Finder寻找基因序列的编码框，利用Prot-Param和Smart进行蛋白的理论性质和保守结构域预测，利用NetPhos 3.1 Server和DictyOGlvc 1.1 Server预测氨基酸序列磷酸化及O-糖基化修饰情况，利用ProtScale分析蛋白质的疏水性，利用SignalP1.1Server、TMHMM Sever 2.0和PSORT II预测蛋白的信号肽和亚细胞定位预测，运用SOPMA预测蛋白的二级结构，使用DNAMAN进行氨基酸序列比对及聚类分析。
1.7 qPCR检测
利用SYBR*Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒在CFX96Real-Time PCR Detection System上进行qPCR检测，内参基因为Ubq-real，其引物序列（Ubq-real-F和Ubq-real-R）见表1。反应体系25.0μL：SYBR Pre-mix Ex Taq Ⅱ 12.5μL，正、反向引物（qPCR-F和qPCR-R）各1.0μL，DNA模板（<100 ng）2.0μL，ddI-120补足至25.0μL。扩增程序：95℃预变性30 s；95℃5 s，60℃30 s，进行40个循环。利用Bio-Rad CFX Manager 2.1数据分析模块分析OsXDH基因的表达丰度。
1.8 XDH活性测定
称取0.2 g去除叶脉的水稻剑叶碎片，液氮研磨2～3次后加入800.0μL蛋白提取液研磨至糊状；将研磨液移入2 mL离心管，4℃下14000 r/min离心20 min后取上清液，65℃水浴90 s变性，再离心取上清液；取10μL上清液放入5 mL离心管中，加入490.0μLddH2O和4.5 mL考马斯亮蓝溶液混匀，于595 nm波长下测定OD值。利用牛血清蛋白制作标准曲线，测定可溶性蛋白含量，并进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量为50 ug，时长为4 h，将胶片放至以次黄嘌呤为底物和以氮蓝四唑为显色剂的混合溶液中，暗处20 min，用冰醋酸清洗后成像（Sagiet al.，1998）。
1.9叶绿素含量测定
参照Lichtenthaler和Wellbuen（1983）的方法，用80%丙酮溶液提取水稻叶片叶绿素，并用分光光度法测定其含量。
1.10统计分析 试验数据采用Excel 2007进行整理作图；利用SPSS 22.0进行显著性分析（One-way ANOVA）。
2结果与分析
2.1 OsXDH基因cDNA编码区的克隆结果
以反转录合成的cDNA为模板，以CDS-F和CDS-R为引物，PCR扩增获得目的片段。结果如图1所示，目的片段约4500 bp，与预期结果相符。测序结果显示，克隆获得的OsXDH基因序列长度为4316bp，其开放阅读框（ORF）长度为4110 bp，编码1369个氨基酸（图2）。将OsXDH基因序列提交至Gen-Bank，登录号LOC4333171。OsXDH基因与基因组DNA序列的比对结果显示，该基因含有14个外显子和13个内含子。
2.2 0sXDH蛋白的生物信息学分析结果
2.2.1理化性质 OsXDH蛋白的理化性质预测结果显示，其分子式为C6713H10509N182501976857，分子量为150.23 kD，理论等电点（pI）为6.54；丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸和缬氨酸个数分别占0sXDH蛋白氨基酸总数的8.0%、8.2%、8.6%和7.7%，不含蛋氨酸和含硒半胱氨酸；不稳定指数为38.87，表明其为稳定蛋白。
2.2.2保守结构域 OsXDH蛋白不仅存在1个CO_deh_flav_C结构域（455～561 aa），可与钼结合形成钼辅因子，构成XDH底物的结合部位和氧化还原部位，还存在1个进化保守的蛋白结构域Aid Xandh C（620～727 aa），此结构域仅存在于醛氧化酶和黄嘌呤脱氢酶中，由此推测黄嘌呤脱氢酶与醛氧化酶具有相似的功能，均可参与植物对非生物胁迫的响应。
2.2.3蛋白磷酸化和糖基化位点 氨基酸残基的磷酸化和糖基化可调节蛋白的活性和功能。0sXDH蛋白氨基酸序列中发生磷酸化修饰的位点有131个，其中色氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化修饰位点分别有71、45和15个（图3）；发生O-糖基化修饰的位点仅1个（图4）。通过预测磷酸化与O-糖基化修饰位点，为黄嘌呤脱氢酶翻译后修饰调控研究提供参考。
2.2.4信号肽及亚细胞定位 信号肽预测结果显示，OsXDH蛋白信号肽平均值为0.106（<0.500），推测其为非分泌蛋白，在细胞质中合成后不被转运。利用TargetP 1.1 Server预测发现OsXDH蛋白广泛位于细胞内（除叶绿体和线粒体外），而pSORTⅡ预测其位于叶绿体中，存在明显分歧，因此，其实际位置需利用免疫荧光、GFP融合表达等技术进一步确认。
2.2.5二级结构 OsXDH蛋白的二级结构中，无规则卷曲（Random coil，C）占35.43%，α-螺旋（α-he-liX，H）占31.56%，延伸链（Extended strand，E）占22.86%，β-转角（β-turn，t）占10.15%。如图5所示，4种二级结构分布较均匀。
2.2.6 亲/疏水性 蛋白的亲/疏水性有助于提高其稳定性及多样性，与其结构和功能密切相关。由图6可知，0sXDH蛋白疏水性最强的位点为第1314位，分值2.389；亲水性最强的位点为第1029位，分值-3.589，亲水性平均值为-0.098，由此推测0sXDH为亲水性蛋白。
2.2.7同源比对及系统发育进化树分析 从NCBI数据库筛选获得5种作物的XDH蛋白氨基酸序列，并与OsXDH蛋白的氨基酸序列进行比对，结果显示OsXDH蛋白的氨基酸序列与高粱（Sorghum bico-lot）、谷子（Setaria italica）、小麦（Aegilops tauschii）、玉米（Zea mays）和油菜（Brassica napus）XDH氨基酸序列相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%（图7）。系统发育进化树分析结果表明，单子叶植物和双子叶植物XDH蛋白同系物分别聚在两个不同的分支，表明XDH蛋白在单子叶植物和双子叶植物间存在一定的分化，但XDH蛋白在同种属间保守性较高，如水稻与小麦、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、谷子和高粱同属一个小分支，均为禾本科植物，XDH蛋白具有较高的同源性；虽然玉米同属禾本科植物，但与芦笋、油棕、芭蕉和蝴蝶兰分属于单子叶植物的另一分支群（图8），其原因可能与物种起源地环境有关，玉米、芦笋、油棕、芭蕉和蝴蝶兰均起源于热带或亚热带地区。综上所述，植物中XDH蛋白的氨基酸序列具有高度保守性，水稻OsXDH蛋白与小麦、二穗短柄草的XDH蛋白分子进化距离最小，亲缘关系最近。
2.3 OsXDH基因表达特性分析结果
2.3.1 OsXDH基因组织表达特性 从图9-A可知，苗期OsXDH基因在水稻根、茎和叶（主茎最上部叶）中的表达量无显著差异（P<0.05，下同）。从图9-B可知，苗期和分蘖盛期OsXDH基因在水稻主茎最上部叶片的表达量无显著差异，但灌浆期OsXDH基因的表达量显著高于苗期和分蘖盛期，由此推测OsXDH基因为特异性表达，参与水稻生长发育相关的分子调控。
2.3.2不同胁迫下OsXDH基因的表达情况 由图10可知，不同胁迫处理均可诱导水稻OsXDH基因上调表达，其中干旱、黑暗和高温胁迫处理后OsXDH基因的表达量均显著高于胁迫处理前，恢复生长7 d后其表达量显著降低，但仍显著高于胁迫处理前，尤其是干旱和高温胁迫处理后OsXDH基因的表达量增至胁迫处理前的2.5倍。盐胁迫处理后OsXDH基因的表达量显著高于胁迫处理前，恢复生长7 d后其表达量显著降低，但与胁迫处理前无显著差异。可见，OsXDH基因的表达受到逆境胁迫因子诱导高效表达，参与逆境胁迫响应。
2.4 OsXDH基因表达量对水稻乳熟期生理指标的影响
对野生型、OsXDH干扰转基因株系及过表达转基因株系乳熟期剑叶的OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析，结果表明，OsXDH干扰转基因株系的OsXDH基因表达量均显著低于野生型和OsXDH过表达转基因株系，OsXDH过表达转基因株系的OsXDH基因表达量均显著高于野生型（图11-A）；OsXDH干扰转基因株系XDH活性低于野生型，而OsXDH过表达转基因株系高于野生型（图11-B）；OsXDH干扰转基因株系的叶绿素含量显著低于野生型和OsXDH过表达转基因株系，OsXDH过表达转基因株系的叶绿素含量高于野生型，但未达显著水平（圖11-C）。表明OsXDH基因表达量、XDH活性与叶绿素含量呈正相关，结合水稻不同生育时期OsXDH基因的表达特性，推测OsXDH基因参与调控水稻生育后期的生长发育。 3讨论
本研究从粳稻品种日本晴中克隆获得OsXDH基因ORF序列，长度为4110 bp，编码1369个氨基酸。已有研究表明，拟南芥和兰科植物的XDH基因均属于核基因（Xiong et al.，2001；Hesberg et al.，2004；G6miak et al.，2010），但本研究中不同生物信息学软件对OsXDH蛋白亚细胞定位结果不同，故未能明确其位置，需利用免疫荧光、GFP融合表达等技术进行蛋白亚细胞定位。此外，本研究通过同源比对及聚类分析，发现水稻OsXDH蛋白的氨基酸序列与单子叶作物高粱、小米和小麦的同源性较高，均在80.00%以上，虽然单子叶与双子叶植物分属不同分支，但其同源性仍在70.00%以上，证明不同植物中XDH蛋白的氨基酸序列具有高度的保守性，推測其在不同植物中发挥相似的生理功能。
本研究发现OsXDH基因在不同组织及不同生育期均有表达，但其在水稻灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期，表明OsXDH基因为特异性表达。同时本研究发现，在干旱、黑暗、高温和盐胁迫下，OsXDH基因表达量显著上调，尤其在干旱和高温胁迫下其增至胁迫处理前的2.5倍，推测水稻OsX-DH基因参与逆境胁迫响应。这与Hesberg等（2004）研究发现拟南芥中AtXDH1基因受不同逆境胁迫因子诱导均表达上调的结论一致。说明不同植物中的XDH基因具有相似表达调控功能。
本研究利用OsXDH干扰转基因株系和过表达转基因株系，对OsXDH基因的功能进行初步鉴定，结果显示，OsXDH干扰转基因株系中的XDH活性和叶绿素含量低于野生型，而OsXDH过表达转基因株系的XDH活性和叶绿素含量均高于野生型，表明通过调控OsXDH基因的表达水平可调节水稻XDH活性，从而调控水稻的生长发育，与前人在拟南芥中的研究结果（Nakagawa et al.，2007；Watanabe et al.，2010；Zarepour et al.，2010；Watanabe et al.，2014）一致。由此推测OsXDH基因参与调控水稻生育后期的生长发育。在今后的研究中，可利用OsXDH～-扰转基因株系和过表达转基因株系进一步研究OsX-DH基因水稻在生长发育及逆境胁迫应答过程中的调控机制。
4结论
OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达，推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因。