【摘 要】
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目的 构建钙调蛋白(CaM)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,C-lobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定.方法 将
【机 构】
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中国医科大学药学院药物毒理教研室,沈阳,110122
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目的 构建钙调蛋白(CaM)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,C-lobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定.方法 将上述cDNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化.采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradfo rd方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性.结果 蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav l.2型钙通道结合并可恢复已“rundown”心肌细胞膜钙通道的活性.结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究CaM的生物学功能奠定了基础.
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