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摘要：分析橡胶草HMGR基因的表达情况，构建原核表达载体，转化BL21菌株并诱导表达。构建细胞融合表达载体，转化GV3101菌株并侵染洋葱表皮细胞，在共聚焦显微镜下观察基因表达情况。构建植物过表达载体并侵染烟草，利用紫外分光光度法检测三萜含量的变化。通过IPTG诱导和SDS-PAGE检测，获得分子量为62659 1 ku的蛋白，与预期蛋白相符合，且37 ℃诱导6 h时表达最明显；通过激光共聚焦显微镜观察，该基因主要在细胞膜上表达；紫外可见分光光度法表明转基因烟草中三萜的含量高于空白烟草。橡胶草HMGR基因分别在大肠杆菌、洋葱鳞片内表皮和烟草中成功表达。
关键词：橡胶草；HMGR基因；原核表达；亚细胞定位；总三萜提取物
中图分类号： Q786文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0042-04
收稿日期：2016-03-31
基金项目：国家自然科学基金（编号：31360060）。
作者简介：赵李婧（1989—），女，山西晋城人，硕士研究生，主要从事植物基因工程的研究。E-mail：851409674@qqcom。
通信作者：闫洁，博士，副教授，主要从事生物化学和分子生物学教学和科研工作。E-mail：1653842328@qqcom。
天然橡胶的生物合成是通过产胶植物体内的异戊二烯代谢途径完成的，而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMGR）基因及其启动子是该代谢途径中的关键限速酶基因，它控制着碳流的流向和代谢反应速率，也是萜类化合物代谢调控的重要位点。目前，已经从橡胶树、水稻、甘草、皂苷、阳春砂、三七、雷公藤、拟南芥、番茄、杜仲等植物中克隆得到了该酶的基因及其启动子，它们以基因家族的形式存在并控制着代谢途径中产物的合成[2-11]。研究发现，HMGR基因在萜类化合物合成中起着关键的调节作用，例如转拟南芥[WTBX][STBX]HMGR1[WTBZ][STBZ]基因的番茄中植物淄醇含量增加到24倍[12]。烟草已具备了成熟的遗传转化体系，是研究基因功能的理想模式植物。从橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）中克隆得到的HMGR基因是橡胶产胶代谢途径中的关键限速酶基因，为了进一步研究橡胶草的HMGR基因功能，本研究构建了HMGR基因的原核表达载体和植物过表达载体，转化DE3大肠菌株、在洋葱鳞片叶表皮瞬时表达，并通过农杆菌叶盘转化法转化烟草，以便进一步研究该基因在异戊二烯代谢途径中的功能，并为研究产胶代谢调控机理奠定基础。采用基因工程的方法，对橡胶草HMGR基因的原核表达、亚细胞定位和真核表达进行了分析，为进一步揭示基因的功能和为后续研究奠定了基础。
1材料与方法
11试验材料
111材料
橡胶草植株，于2011年6月采自新疆石河子蘑菇湖旁边，后移栽至实验室栽培室进行室内培养；“NC89”野生型烟草，由笔者所在实验室提供；齐墩果酸标准品，购自北京全式金生物技术有限公司；新鲜生长良好的洋葱，购自石河子蔬菜市场。
112菌株、质粒及试剂
大肠杆菌Top10、农杆菌GV3101、植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS、细胞融合表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，均由笔者所在实验室保存。植物总RNA提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；SuperRT cDNA Kit，购自北京康为世纪生物科技有限公司；Blue Plus Ⅲ Protein Marker，购自北京全式金生物技术有限公司；引物均由华大基因合成，其他试剂均为国产或进口分析纯。
113仪器
冷冻干燥机LGJ-10C、紫外-可见分光光度计、激光共聚焦显微镜IN Cell Analyzer 3000，均购自上海分析仪器厂。
12试验方法
121原核表达载体的构建
为了研究该基因的蛋白表达情况，构建了原核表达载体。将PET-30a质粒和pGEMT-T-HMGR 质粒分别用BamHⅠ和SalⅡ进行双酶切，酶切体系为20 μL，7 μL质粒、2 μL 10×T buffer、BamHⅠ和SalⅡ各 1 μL，然后加无菌水至20 μL，将反应体系置于37 ℃水浴中酶切4 h，4 h后跑核酸电泳检测。切胶回收PET-30a（ ）载体片段和TkHMGR基因片段，将回收的片段用T4 DNA连接酶连接，连接体系为10 μL，PET-30a（ ）和TkHMGR各 4 μL、1 μL 10×Loading buffer、1 μL T4 DNA連接酶，反应体系置于4 ℃水浴过夜连接，将连接产物转化Top10感受态细胞，在添加了卡那霉素（Kan）的LB固体培养基上挑取重组质粒，通过PCR反应和双酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证。进行PCR反应时，取pGEMT-T-HMGR质粒为模板作为阳性对照，以加双蒸水为模板作为阴性对照。成功构建的载体命名为PET-30a-TkHMGR，将测序正确的质粒电击转化BL21（DE3）。
122重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
将转化成功的BL21（DE3）-PET-30a-TkHMGR接种到50 mL含Kan的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min过夜培养后吸取05 mL到50 mL含Kan的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min继续培养使其D600 nm值达到04时（大约2 h），加异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为05 mmol/mL，以不加IPTG和转BL21（DE3）-PET-30a质粒的菌液为对照，于37 ℃、220 r/min 继续培养，每隔2 h取2 mL菌液于离心管中，4 ℃、6 000 r/min 离心10 min收集沉淀，然后在沉淀中加入 025 mL 冰浴的磷酸盐缓冲液充分混匀沉淀，再向其中加入0025 mL 5×SDS-PAGE电泳缓冲液，充分混匀后放置 5 min，在 100 ℃ 水浴中煮沸5 min，使蛋白变性后冷却至室温，12 000 r/min 离心10 min，取上清液即为诱导表达的重组蛋白。 123植物过表达载体的构建和绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体的构建
为了研究该基因的功能和亚细胞定位，构建了植物过表达载体和GFP融合表达载体。以橡胶草cDNA为模板，qHMGR上（XbaⅠ）和qHMGE下（SalⅡ）、HMGR-GFP上（BamHⅠ）和HMGR-GFP下（XbalⅡ）分别为引物克隆了TkHMGR基因和去终止子的TkHMGR基因，回收目的片段与克隆载体pGEM-T Easy Voctor连接，构建pGEM-T-TkHNGR和pGEM-T-TkHNGR（去終止子）。分别用XbaⅠ和SalⅡ双酶切重组质粒pGEM-T-TkHMGR和pCAMBIA2300-35S-OCS，用BamHⅠ和XbalⅡ双酶切pGEM-T-TkHNGR（去终止子）和pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，获得目的基因片段和载体大片段。将大小片段进行连接，然后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，Kan筛选融合表达载体pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS和pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS。用电击转化法将重组质粒转化根癌农杆菌GV3101，挑取阳性克隆，进行PCR扩增和双酶切鉴定。进行PCR反应时，取pGEMT-T-HMGR质粒为模板作为阳性对照，以加双蒸水为模板作为阴性对照。PCR扩增所用的引物及引物序列如表1所示。
124洋葱表皮细胞的侵染、培养和GFP观察
选取新鲜的生长良好的洋葱，将鳞茎在75%乙醇中浸泡10 min，用无菌水冲洗3～4次，再用无菌解剖刀取1 cm×1 cm×1 cm的球茎内表皮，贴近叶肉的一面朝下平铺于1/2 MS固体培养基中，28 ℃暗培养4 h，将预培养的洋葱方块用含有pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS质粒的农杆菌菌液侵染25 min，用滤纸吸干表面的菌液，转入1/2 MS固体培养基中25 ℃光照培养2 d。将培养好的洋葱鳞片用干净的MS液体洗涤，以除去附着的农杆菌，把1 cm×1 cm×1 cm的鳞片做成装片，用激光共聚焦显微镜于488 nm波长下观察荧光蛋白在细胞内的表达情况。
125烟草的遗传转化
通过叶盘转化法将含有质粒pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS的农杆菌GV3101转化“NC89”的野生型烟草。提取转化pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS质粒烟草的DNA，以上游引物BamHⅠ和下游引物SalⅡ进行PCR鉴定，提取烟草的RNA，以HMGR定上和HMGR定下为上游、下游引物进行RT-PCR鉴定。所用引物序列如表1所示。
126转基因烟草中三萜类化合物含量的测定
1261三萜的提取方法
分别取100 mg 60 ℃干燥的野生型和转基因的烟草材料，精确称量后置于10 mL离心管中，加入3 mL 95%乙醇于50 ℃提取（提取3次），将提取液合并转移至50 mL离心管中，8 000 r/min离心10 min，上清液转移至新的50 mL离心管中，50 ℃真空干燥；用3 mL蒸馏水溶解干粉，再用同体积的三氯甲烷抽提，转移三氯甲烷相，在三氯甲烷相中加饱和的NaHCO3溶液，抽提转移上层NaHCO3相于新的离心管中，缓慢加入浓盐酸使pH值低于30；加同体积的三氯甲烷抽提，取三氯甲烷相转移至新管，真空冷冻干燥，用3 mL甲醇溶解，测定其D560 nm。
1262制作标准曲线
取12 mg齐墩果酸标准品，用无水乙醇定容至10 mL，定容后分别吸取01、02、03、04、05、06 mL于试管中，加无水乙醇补足1 mL，空白对照加1 mL无水乙醇，所有试管于沸水中水浴直至溶剂挥发完；然后在试管中加04 mL 5%香草醛冰乙酸、16 mL高氯酸，迅速混匀；将试管于70 ℃水浴中放置15 min，取出冷却至室温，加8 mL乙酸乙酯迅速混匀，测定其D560 nm，并绘制标准曲线。
2结果与分析
21原核表达载体的构建和鉴定
pGEMT-T-TkHMGR和PET-30a质粒用BamHⅠ和SalⅡ进行双酶切，成功构建了载体PET-30a-TkHMGR，电击转化BL21（DE3）细胞，挑取阳性克隆菌液进行PCR扩增和双酶切鉴定。由图1可知，TkHMGR基因成功地连接到了PET-30a表达载体上，说明成功构建了原核表达载体。
22SDS-PAGE分析
经IPTG诱导表达后提取大肠杆菌菌体总蛋白，将提取的蛋白进行SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，结果表明，随着诱导时间的延长，分子量约为62659 1 ku的蛋白表达量随之增加，在6 h时表达量达到最高值。由图2可知，TkHMGR基因在大肠杆菌中成功诱导表达。
23细胞融合表达载体的构建和鉴定
将重组质粒pGEMT-T-TkHMGR（去终止子）和pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS质粒用BamHⅠ和XbalⅡ进行双酶切，成功构建了植物融合表达载体pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS，电击转化农杆菌GV3101细胞，挑[CM（25]取阳性克隆菌液进行PCR扩增和双酶切鉴定，由图
可知，TkHMGR基因成功地连接到pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS表达载体上，图3-b说明成功构建了细胞融合表达载体。
24TkHMGR蛋白亚细胞定位分析
为了研究TkHMGR蛋白的亚细胞定位情况，取转基因的洋葱鳞片内表皮制作压片，在激光共聚焦显微镜下观察。由图4可知，TkHMGR融合蛋白主要在膜上表达，而35S-GFP对照在整个细胞内均有绿色荧光。由此推测，TkHMGR蛋白可能主要在细胞膜和细胞核膜上表达，这与王启超等通过Psort程序（http：//psortnibbacjp）分析预测的结果相符合。 25标准曲线的建立
以齐墩果酸反应体系的吸光度为横坐标、齐墩果酸标准品的含量为纵坐标作标准曲线（图5），得回归方程y=20688x 0181，r2=0999 1。
26转基因烟草中总三萜含量的测定
由图6可知，烟草中转Hb-HMGR基因的三萜类化合物含量略高于转35S-基因，而两者的三萜类化合物含量都明显高于空白烟草。
3讨论与结论
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A基因是一类庞大的基因家族，在植物体异戊二烯代谢途径中扮演着重要的角色，是代谢途径中的关键酶和限速酶。研究该基因编码蛋白质的亚细胞定位能为蛋白质功能的研究提供重要的信息，关于该基因的亚细胞定位目前还未见报道，只有王启超等预测了该基因主要定位于细胞膜和细胞器膜。试验结果表明，该基因主要在膜上表达，与预测结果相符。对HMGR基因进行原核表达分析，结果表明该基因可以成功地在大肠杆菌中表达，并得到了相应的蛋白。
目前为止，关于HMGR基因调控萜类物质代谢的研究已有很多，关于橡胶草HMGR基因在萜类物质代谢中作用的研究还未见报道。本研究使大量HMGR蛋白在烟草中积累，对烟草中三萜含量进行检测，发现烟草叶中的三萜含量显著提高。大量研究表明，在烟草中过量表达阳春砂的HMGR基因可以有效地促进甾醇的生物合成[14]。Chappell等在研究中发现，HMGR的活性提高可以诱导倍半萜环化酶的活性，进而提高了倍半萜的产量[15]。武莹利用壳聚糖诱导雷公藤叶悬浮细胞，通过检测发现3种萜类代谢物含量提高，HMGR基因表达水平也相应提高，表明HMGR基因对萜类物质的合成具有正调控作用[16]。目前研究表明，HMGR基因的表达可能控制着甲羟戊酸代谢、碳流的流向和萜类物质的合成[17]，为进一步研究橡胶草HMGR基因调控产胶代谢机理奠定了理论基础。
本研究采用基因工程的方法，分别从原核表达、亚细胞定位和转基因烟草3个方面对橡胶草HMGR基因进行了分析。原核表达分析结果表明，该基因编码的蛋白相对分子质量为62659 1 ku；通过构建该基因的瞬时表达载体，运用叶盘转化法侵染洋葱表皮细胞对该基因编码的蛋白亚细胞定位进行分析，表明该基因编码的蛋白定位在细胞膜和核膜上，与生物信息学分析结果相一致；转基因烟草的试验结果表明，通过基因工程的方法可以控制烟草中萜类化合物的合成，从而提高烟草中总三萜的含量，为研究植物异戊二烯代谢途径次生代谢产物的合成打下了基础。
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关键词：橡胶草；HMGR基因；原核表达；亚细胞定位；总三萜提取物
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文章编号：1002-1302（2017）16-0042-04
收稿日期：2016-03-31
基金项目：国家自然科学基金（编号：31360060）。
作者简介：赵李婧（1989—），女，山西晋城人，硕士研究生，主要从事植物基因工程的研究。E-mail：851409674@qqcom。
通信作者：闫洁，博士，副教授，主要从事生物化学和分子生物学教学和科研工作。E-mail：1653842328@qqcom。
天然橡胶的生物合成是通过产胶植物体内的异戊二烯代谢途径完成的，而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMGR）基因及其启动子是该代谢途径中的关键限速酶基因，它控制着碳流的流向和代谢反应速率，也是萜类化合物代谢调控的重要位点。目前，已经从橡胶树、水稻、甘草、皂苷、阳春砂、三七、雷公藤、拟南芥、番茄、杜仲等植物中克隆得到了该酶的基因及其启动子，它们以基因家族的形式存在并控制着代谢途径中产物的合成[2-11]。研究发现，HMGR基因在萜类化合物合成中起着关键的调节作用，例如转拟南芥[WTBX][STBX]HMGR1[WTBZ][STBZ]基因的番茄中植物淄醇含量增加到24倍[12]。烟草已具备了成熟的遗传转化体系，是研究基因功能的理想模式植物。从橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）中克隆得到的HMGR基因是橡胶产胶代谢途径中的关键限速酶基因，为了进一步研究橡胶草的HMGR基因功能，本研究构建了HMGR基因的原核表达载体和植物过表达载体，转化DE3大肠菌株、在洋葱鳞片叶表皮瞬时表达，并通过农杆菌叶盘转化法转化烟草，以便进一步研究该基因在异戊二烯代谢途径中的功能，并为研究产胶代谢调控机理奠定基础。采用基因工程的方法，对橡胶草HMGR基因的原核表达、亚细胞定位和真核表达进行了分析，为进一步揭示基因的功能和为后续研究奠定了基础。
1材料与方法
11试验材料
111材料
橡胶草植株，于2011年6月采自新疆石河子蘑菇湖旁边，后移栽至实验室栽培室进行室内培养；“NC89”野生型烟草，由笔者所在实验室提供；齐墩果酸标准品，购自北京全式金生物技术有限公司；新鲜生长良好的洋葱，购自石河子蔬菜市场。
112菌株、质粒及试剂
大肠杆菌Top10、农杆菌GV3101、植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS、细胞融合表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，均由笔者所在实验室保存。植物总RNA提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；SuperRT cDNA Kit，购自北京康为世纪生物科技有限公司；Blue Plus Ⅲ Protein Marker，购自北京全式金生物技术有限公司；引物均由华大基因合成，其他试剂均为国产或进口分析纯。
113仪器
冷冻干燥机LGJ-10C、紫外-可见分光光度计、激光共聚焦显微镜IN Cell Analyzer 3000，均购自上海分析仪器厂。
12试验方法
121原核表达载体的构建
为了研究该基因的蛋白表达情况，构建了原核表达载体。将PET-30a质粒和pGEMT-T-HMGR 质粒分别用BamHⅠ和SalⅡ进行双酶切，酶切体系为20 μL，7 μL质粒、2 μL 10×T buffer、BamHⅠ和SalⅡ各 1 μL，然后加无菌水至20 μL，将反应体系置于37 ℃水浴中酶切4 h，4 h后跑核酸电泳检测。切胶回收PET-30a（ ）载体片段和TkHMGR基因片段，将回收的片段用T4 DNA连接酶连接，连接体系为10 μL，PET-30a（ ）和TkHMGR各 4 μL、1 μL 10×Loading buffer、1 μL T4 DNA連接酶，反应体系置于4 ℃水浴过夜连接，将连接产物转化Top10感受态细胞，在添加了卡那霉素（Kan）的LB固体培养基上挑取重组质粒，通过PCR反应和双酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证。进行PCR反应时，取pGEMT-T-HMGR质粒为模板作为阳性对照，以加双蒸水为模板作为阴性对照。成功构建的载体命名为PET-30a-TkHMGR，将测序正确的质粒电击转化BL21（DE3）。
122重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
将转化成功的BL21（DE3）-PET-30a-TkHMGR接种到50 mL含Kan的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min过夜培养后吸取05 mL到50 mL含Kan的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min继续培养使其D600 nm值达到04时（大约2 h），加异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为05 mmol/mL，以不加IPTG和转BL21（DE3）-PET-30a质粒的菌液为对照，于37 ℃、220 r/min 继续培养，每隔2 h取2 mL菌液于离心管中，4 ℃、6 000 r/min 离心10 min收集沉淀，然后在沉淀中加入 025 mL 冰浴的磷酸盐缓冲液充分混匀沉淀，再向其中加入0025 mL 5×SDS-PAGE电泳缓冲液，充分混匀后放置 5 min，在 100 ℃ 水浴中煮沸5 min，使蛋白变性后冷却至室温，12 000 r/min 离心10 min，取上清液即为诱导表达的重组蛋白。 123植物过表达载体的构建和绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体的构建
为了研究该基因的功能和亚细胞定位，构建了植物过表达载体和GFP融合表达载体。以橡胶草cDNA为模板，qHMGR上（XbaⅠ）和qHMGE下（SalⅡ）、HMGR-GFP上（BamHⅠ）和HMGR-GFP下（XbalⅡ）分别为引物克隆了TkHMGR基因和去终止子的TkHMGR基因，回收目的片段与克隆载体pGEM-T Easy Voctor连接，构建pGEM-T-TkHNGR和pGEM-T-TkHNGR（去終止子）。分别用XbaⅠ和SalⅡ双酶切重组质粒pGEM-T-TkHMGR和pCAMBIA2300-35S-OCS，用BamHⅠ和XbalⅡ双酶切pGEM-T-TkHNGR（去终止子）和pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，获得目的基因片段和载体大片段。将大小片段进行连接，然后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，Kan筛选融合表达载体pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS和pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS。用电击转化法将重组质粒转化根癌农杆菌GV3101，挑取阳性克隆，进行PCR扩增和双酶切鉴定。进行PCR反应时，取pGEMT-T-HMGR质粒为模板作为阳性对照，以加双蒸水为模板作为阴性对照。PCR扩增所用的引物及引物序列如表1所示。
124洋葱表皮细胞的侵染、培养和GFP观察
选取新鲜的生长良好的洋葱，将鳞茎在75%乙醇中浸泡10 min，用无菌水冲洗3～4次，再用无菌解剖刀取1 cm×1 cm×1 cm的球茎内表皮，贴近叶肉的一面朝下平铺于1/2 MS固体培养基中，28 ℃暗培养4 h，将预培养的洋葱方块用含有pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS质粒的农杆菌菌液侵染25 min，用滤纸吸干表面的菌液，转入1/2 MS固体培养基中25 ℃光照培养2 d。将培养好的洋葱鳞片用干净的MS液体洗涤，以除去附着的农杆菌，把1 cm×1 cm×1 cm的鳞片做成装片，用激光共聚焦显微镜于488 nm波长下观察荧光蛋白在细胞内的表达情况。
125烟草的遗传转化
通过叶盘转化法将含有质粒pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS的农杆菌GV3101转化“NC89”的野生型烟草。提取转化pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS质粒烟草的DNA，以上游引物BamHⅠ和下游引物SalⅡ进行PCR鉴定，提取烟草的RNA，以HMGR定上和HMGR定下为上游、下游引物进行RT-PCR鉴定。所用引物序列如表1所示。
126转基因烟草中三萜类化合物含量的测定
1261三萜的提取方法
分别取100 mg 60 ℃干燥的野生型和转基因的烟草材料，精确称量后置于10 mL离心管中，加入3 mL 95%乙醇于50 ℃提取（提取3次），将提取液合并转移至50 mL离心管中，8 000 r/min离心10 min，上清液转移至新的50 mL离心管中，50 ℃真空干燥；用3 mL蒸馏水溶解干粉，再用同体积的三氯甲烷抽提，转移三氯甲烷相，在三氯甲烷相中加饱和的NaHCO3溶液，抽提转移上层NaHCO3相于新的离心管中，缓慢加入浓盐酸使pH值低于30；加同体积的三氯甲烷抽提，取三氯甲烷相转移至新管，真空冷冻干燥，用3 mL甲醇溶解，测定其D560 nm。
1262制作标准曲线
取12 mg齐墩果酸标准品，用无水乙醇定容至10 mL，定容后分别吸取01、02、03、04、05、06 mL于试管中，加无水乙醇补足1 mL，空白对照加1 mL无水乙醇，所有试管于沸水中水浴直至溶剂挥发完；然后在试管中加04 mL 5%香草醛冰乙酸、16 mL高氯酸，迅速混匀；将试管于70 ℃水浴中放置15 min，取出冷却至室温，加8 mL乙酸乙酯迅速混匀，测定其D560 nm，并绘制标准曲线。
2结果与分析
21原核表达载体的构建和鉴定
pGEMT-T-TkHMGR和PET-30a质粒用BamHⅠ和SalⅡ进行双酶切，成功构建了载体PET-30a-TkHMGR，电击转化BL21（DE3）细胞，挑取阳性克隆菌液进行PCR扩增和双酶切鉴定。由图1可知，TkHMGR基因成功地连接到了PET-30a表达载体上，说明成功构建了原核表达载体。
22SDS-PAGE分析
经IPTG诱导表达后提取大肠杆菌菌体总蛋白，将提取的蛋白进行SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，结果表明，随着诱导时间的延长，分子量约为62659 1 ku的蛋白表达量随之增加，在6 h时表达量达到最高值。由图2可知，TkHMGR基因在大肠杆菌中成功诱导表达。
23细胞融合表达载体的构建和鉴定
将重组质粒pGEMT-T-TkHMGR（去终止子）和pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS质粒用BamHⅠ和XbalⅡ进行双酶切，成功构建了植物融合表达载体pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS，电击转化农杆菌GV3101细胞，挑[CM（25]取阳性克隆菌液进行PCR扩增和双酶切鉴定，由图
可知，TkHMGR基因成功地连接到pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS表达载体上，图3-b说明成功构建了细胞融合表达载体。
24TkHMGR蛋白亚细胞定位分析
为了研究TkHMGR蛋白的亚细胞定位情况，取转基因的洋葱鳞片内表皮制作压片，在激光共聚焦显微镜下观察。由图4可知，TkHMGR融合蛋白主要在膜上表达，而35S-GFP对照在整个细胞内均有绿色荧光。由此推测，TkHMGR蛋白可能主要在细胞膜和细胞核膜上表达，这与王启超等通过Psort程序（http：//psortnibbacjp）分析预测的结果相符合。 25标准曲线的建立
以齐墩果酸反应体系的吸光度为横坐标、齐墩果酸标准品的含量为纵坐标作标准曲线（图5），得回归方程y=20688x 0181，r2=0999 1。
26转基因烟草中总三萜含量的测定
由图6可知，烟草中转Hb-HMGR基因的三萜类化合物含量略高于转35S-基因，而两者的三萜类化合物含量都明显高于空白烟草。
3讨论与结论
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A基因是一类庞大的基因家族，在植物体异戊二烯代谢途径中扮演着重要的角色，是代谢途径中的关键酶和限速酶。研究该基因编码蛋白质的亚细胞定位能为蛋白质功能的研究提供重要的信息，关于该基因的亚细胞定位目前还未见报道，只有王启超等预测了该基因主要定位于细胞膜和细胞器膜。试验结果表明，该基因主要在膜上表达，与预测结果相符。对HMGR基因进行原核表达分析，结果表明该基因可以成功地在大肠杆菌中表达，并得到了相应的蛋白。
目前为止，关于HMGR基因调控萜类物质代谢的研究已有很多，关于橡胶草HMGR基因在萜类物质代谢中作用的研究还未见报道。本研究使大量HMGR蛋白在烟草中积累，对烟草中三萜含量进行检测，发现烟草叶中的三萜含量显著提高。大量研究表明，在烟草中过量表达阳春砂的HMGR基因可以有效地促进甾醇的生物合成[14]。Chappell等在研究中发现，HMGR的活性提高可以诱导倍半萜环化酶的活性，进而提高了倍半萜的产量[15]。武莹利用壳聚糖诱导雷公藤叶悬浮细胞，通过检测发现3种萜类代谢物含量提高，HMGR基因表达水平也相应提高，表明HMGR基因对萜类物质的合成具有正调控作用[16]。目前研究表明，HMGR基因的表达可能控制着甲羟戊酸代谢、碳流的流向和萜类物质的合成[17]，为进一步研究橡胶草HMGR基因调控产胶代谢机理奠定了理论基础。
本研究采用基因工程的方法，分别从原核表达、亚细胞定位和转基因烟草3个方面对橡胶草HMGR基因进行了分析。原核表达分析结果表明，该基因编码的蛋白相对分子质量为62659 1 ku；通过构建该基因的瞬时表达载体，运用叶盘转化法侵染洋葱表皮细胞对该基因编码的蛋白亚细胞定位进行分析，表明该基因编码的蛋白定位在细胞膜和核膜上，与生物信息学分析结果相一致；转基因烟草的试验结果表明，通过基因工程的方法可以控制烟草中萜类化合物的合成，从而提高烟草中总三萜的含量，为研究植物异戊二烯代谢途径次生代谢产物的合成打下了基础。
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