论文部分内容阅读
研究背景
大多数的动物细胞具有纤毛。纤毛主要由外层的膜包覆中心的微管所组成，中心的微管称为轴丝，轴丝是由母亲中心粒当作基体作为地基，向上构筑成双联体九排的微管，并环绕成圆柱形的构造，而基体上的远程附器和细胞膜结合，使纤毛向外长出细胞表面。纤毛发生病变可导致多种疾病，如原发性支气管炎、肝脏和肾脏的多囊性增生等，由此可看出纤毛对于许多细胞的功能具有极大的影响力。
纤毛的生成路径有2 种：细胞内和细胞外路径。小鼠肾小管IMCD3 细胞株的纤毛是借由细胞外路径生成，细胞外路径就是在一般二维培养的情况下，可观察到母亲中心粒移动到细胞膜附近，再向外长出纤毛;视网膜色素上皮细胞株和成纤维细胞株的纤毛则是借由细胞内路径，在此路径中，母亲中心粒维持在细胞中心的位置就可直接长出纤毛。
在极化的上皮细胞中，纤毛发育的过程起始于母亲中心粒，必须从细胞核附近移动到细胞顶端膜附近，再由远程附器结合在顶端膜上，作为基体向细胞顶端长出纤毛，凸出顶端膜表面以感测细胞外界讯号。然而，在细胞外路径中，母亲中心粒是如何移动至顶端膜附近？其如何辨别细胞顶端和底端的方向性？这些分子机制仍然不清楚。
研究方法
本研究以小鼠肾小管IMCD3 细胞株， 在去血清的刺激诱导下， 使IMCD3 细胞长出纤毛，再以免疫荧光染色分析闭锁小带与生成纤毛的关系。并利用克隆形成实验，将IMCD3 细胞株分为4 类形态，也进一步发现在三维培养中，4 种细胞形态皆无法排列成空腔构造。最后建立载体DNA，以绿色荧光标示纤毛蛋白，在活细胞中追踪基体的移动及纤毛生成的过程。期望通过研究纤毛形成的过程机理，能探讨致病的作用机制，找出治疗纤毛病变的方法。
结果与讨论
具完整闭锁小带的细胞通常同时具有纤毛
为了探讨纤毛生成的机制，首先利用免疫荧光染色法观察IMCD3 细胞株，结果发现有完整闭锁小带结构的细胞比没有闭锁小带的细胞更容易形成纤毛。在正常10% 胎牛血清培养液的条件下培养，可发现有一些具有闭锁小带的细胞已经长出纤毛。当细胞培养在去血清的条件下，细胞会停止增生，离开细胞周期，进入G0 期，诱发更多纤毛生成。去血清的培养结果显示，经染色发现有长纤毛的细胞大部分都具有细胞和细胞之间完整的闭锁小带结构，同时具有纤毛与闭锁小带的细胞与同时不具二者的细胞比例最高，因此推测在IMCD3 细胞中，纤毛的生成和闭锁小带的结构有密切关联。
具完整闭锁小带的细胞，纤毛生长基部到细胞底端的距离较长，且纤毛生长在细胞顶端
经免疫荧光染色发现，有完整闭锁小带构造的细胞，纤毛会长在细胞顶端，玻片底部到纤毛基部的距离较长;反之，在破碎闭锁小带构造的细胞中，一些有纤毛生成的细胞，其纤毛比较靠近细胞底部和玻片贴附的区域，显示纤毛未生长在正常的位置。在染有Arl13B和ZO1 的细胞中，自细胞底端至纤毛生长位置基部的距离有完整闭锁小带的细胞，纤毛基部到细胞底端的距离平均大于没有完整闭锁小带的细胞。
另外，纤毛的生成位置对其功能可能造成影响，没有长在细胞膜顶端上的纤毛可能会使细胞无法正常接收讯号，导致疾病。而有完整闭锁小带可以让细胞的极性呈现出来，进而引发细胞上下径的延长，并使纤毛生长在细胞顶端;反之，具有破碎闭锁小带的细胞可能无法显现极性，因而使纤毛无法生长在正确位置。由此结果我们推论，闭锁小带结构的完整性可能和细胞外路径的纤毛生成方式有关。
具完整闭锁小带的细胞能形成立体的空腔构造，且分裂具有正确的方向性
空腔构造中的细胞具极性：在可见光下IMCD3 细胞的空腔细胞在三维培养细胞系统中，可以看到有空腔的细胞群占有九成的比例。以更原始的IMCD3 细胞进行三维培养，观察细胞形成空腔构造的比例，结果发现大多数细胞能形成完整空腔构造。
在空腔构造中，细胞分裂有固定的方向性：因为IMCD3 细胞属于单层细胞构成的球体，为了维持细胞整体的极性，细胞在分裂时会沿着闭锁小带的切线方向分开。在分裂过程中，中心粒会移动到细胞的两极。因此在细胞分裂时，纤毛不会出现在细胞顶端膜上。如果细胞向外或向内分裂，分裂出去的细胞可能会死亡。
细胞密度的增加不能增加闭锁小带的完整性
在显微镜下，将IMCD3 分为4 种形态，4 种细胞群的排列方式皆不同，编号由小到大为细胞排列疏松到紧密。在前面的实验中，我们观察到IMCD3细胞株具有2 类细胞：具完整闭锁小带和具破碎闭锁小带。关于这2 类细胞的关系，我们推测有2 种可能：一是随着细胞生长、细胞密度增加，破碎闭锁小带可发育成完整闭锁小带，二是这个细胞株混合了不同特性的细胞群。为了分辨两种可能性，我们设计克隆形成实验，挑选单一性质的克隆。
以赫斯特染色染活细胞的细胞核，可看出4 个细胞株皆没有长出空腔。我们推论可能与细胞继代的次数有关，因为在原始的细胞株中仍能找到长空腔的IMCD3 细胞。
我们先确认微丝和闭锁小带的位置关系，发现具闭锁小带的细胞和不具闭锁小带的细胞之间的界线没有因为细胞密度增加而消失，反而更加明显。由这个实验我们推论闭锁小带不会因为细胞密度增加而改变原有的形态，所以这4 种形态的细胞可能是具不同特性的细胞群。
纤毛的生成和母亲中心粒有关
以绿色荧光标示纤毛蛋白，搭配红色荧光标示母亲中心粒，以便于活细胞追踪基体的移动及纤毛生成过程。将制作好的质体感染进细胞中，可以看到纤毛以母亲中心体为基底，向外长出纤毛。为了确认是否可以成功标示纤毛，以免疫荧光染色标记母亲中心体，确认位置。
结论与应用
本实验目前的初步结论如下。
??具完整闭锁小带的细胞通常同时具有纤毛。
??具完整闭锁小带的细胞，纤毛生长基部到细胞底端的距离较长，且纤毛生长在细胞顶端。
??具完整闭锁小带的细胞能形成立体的空腔构造，且分裂具有正确的方向性。
??细胞密度的增加不能增加闭锁小带的完整性。
??纤毛的生成和母亲中心粒确实有关。
闭锁小带如何影响细胞极性和纤毛生成呢？我们认为闭锁小带和细胞极性的关系可能和磷脂酰肌醇有关，已表现极性的细胞，其顶端细胞膜含有PIP2，基体可以辨別PIP2，而在顶端的位置长出纤毛，极性细胞的底端细胞膜则含有PIP3，这两类的磷脂酰肌醇分布受到闭锁小带的限制，不会相混。没有闭锁小带的细胞因为细胞膜上顶部和底部的磷脂酰肌醇位置同时混在细胞膜上，可能使基体无法分辨顶端，因而在细胞内长出纤毛。
目前的研究结果显示小鼠肾小管IMCD3 细胞株的纤毛形成和闭锁小带的形成有关联性。这个研究结果不仅对于了解纤毛的生成有帮助，也有助于找出纤毛突变所引发疾病的治疗方法。未来我们会运用活细胞影片实际拍出纤毛生成的过程，也会探讨母亲中心体、高基氏体和纤毛形成的关系，希望能更了解纤毛生成的路径及机制，提供治疗相关疾病的可能方向。
专家评语
细胞纤毛发育缺陷是多种疾病成因之一，但许多情况下其致病机理并不清楚，该项目以小鼠肾小管的细胞株为模型，探讨纤毛缺陷的致病机理。本项目证实具备完整闭锁小带的细胞通常同时具有纤毛，实验完整，有明确研究目的和显著创新。
大多数的动物细胞具有纤毛。纤毛主要由外层的膜包覆中心的微管所组成，中心的微管称为轴丝，轴丝是由母亲中心粒当作基体作为地基，向上构筑成双联体九排的微管，并环绕成圆柱形的构造，而基体上的远程附器和细胞膜结合，使纤毛向外长出细胞表面。纤毛发生病变可导致多种疾病，如原发性支气管炎、肝脏和肾脏的多囊性增生等，由此可看出纤毛对于许多细胞的功能具有极大的影响力。
纤毛的生成路径有2 种：细胞内和细胞外路径。小鼠肾小管IMCD3 细胞株的纤毛是借由细胞外路径生成，细胞外路径就是在一般二维培养的情况下，可观察到母亲中心粒移动到细胞膜附近，再向外长出纤毛;视网膜色素上皮细胞株和成纤维细胞株的纤毛则是借由细胞内路径，在此路径中，母亲中心粒维持在细胞中心的位置就可直接长出纤毛。
在极化的上皮细胞中，纤毛发育的过程起始于母亲中心粒，必须从细胞核附近移动到细胞顶端膜附近，再由远程附器结合在顶端膜上，作为基体向细胞顶端长出纤毛，凸出顶端膜表面以感测细胞外界讯号。然而，在细胞外路径中，母亲中心粒是如何移动至顶端膜附近？其如何辨别细胞顶端和底端的方向性？这些分子机制仍然不清楚。
研究方法
本研究以小鼠肾小管IMCD3 细胞株， 在去血清的刺激诱导下， 使IMCD3 细胞长出纤毛，再以免疫荧光染色分析闭锁小带与生成纤毛的关系。并利用克隆形成实验，将IMCD3 细胞株分为4 类形态，也进一步发现在三维培养中，4 种细胞形态皆无法排列成空腔构造。最后建立载体DNA，以绿色荧光标示纤毛蛋白，在活细胞中追踪基体的移动及纤毛生成的过程。期望通过研究纤毛形成的过程机理，能探讨致病的作用机制，找出治疗纤毛病变的方法。
结果与讨论
具完整闭锁小带的细胞通常同时具有纤毛
为了探讨纤毛生成的机制，首先利用免疫荧光染色法观察IMCD3 细胞株，结果发现有完整闭锁小带结构的细胞比没有闭锁小带的细胞更容易形成纤毛。在正常10% 胎牛血清培养液的条件下培养，可发现有一些具有闭锁小带的细胞已经长出纤毛。当细胞培养在去血清的条件下，细胞会停止增生，离开细胞周期，进入G0 期，诱发更多纤毛生成。去血清的培养结果显示，经染色发现有长纤毛的细胞大部分都具有细胞和细胞之间完整的闭锁小带结构，同时具有纤毛与闭锁小带的细胞与同时不具二者的细胞比例最高，因此推测在IMCD3 细胞中，纤毛的生成和闭锁小带的结构有密切关联。
具完整闭锁小带的细胞，纤毛生长基部到细胞底端的距离较长，且纤毛生长在细胞顶端
经免疫荧光染色发现，有完整闭锁小带构造的细胞，纤毛会长在细胞顶端，玻片底部到纤毛基部的距离较长;反之，在破碎闭锁小带构造的细胞中，一些有纤毛生成的细胞，其纤毛比较靠近细胞底部和玻片贴附的区域，显示纤毛未生长在正常的位置。在染有Arl13B和ZO1 的细胞中，自细胞底端至纤毛生长位置基部的距离有完整闭锁小带的细胞，纤毛基部到细胞底端的距离平均大于没有完整闭锁小带的细胞。
另外，纤毛的生成位置对其功能可能造成影响，没有长在细胞膜顶端上的纤毛可能会使细胞无法正常接收讯号，导致疾病。而有完整闭锁小带可以让细胞的极性呈现出来，进而引发细胞上下径的延长，并使纤毛生长在细胞顶端;反之，具有破碎闭锁小带的细胞可能无法显现极性，因而使纤毛无法生长在正确位置。由此结果我们推论，闭锁小带结构的完整性可能和细胞外路径的纤毛生成方式有关。
具完整闭锁小带的细胞能形成立体的空腔构造，且分裂具有正确的方向性
空腔构造中的细胞具极性：在可见光下IMCD3 细胞的空腔细胞在三维培养细胞系统中，可以看到有空腔的细胞群占有九成的比例。以更原始的IMCD3 细胞进行三维培养，观察细胞形成空腔构造的比例，结果发现大多数细胞能形成完整空腔构造。
在空腔构造中，细胞分裂有固定的方向性：因为IMCD3 细胞属于单层细胞构成的球体，为了维持细胞整体的极性，细胞在分裂时会沿着闭锁小带的切线方向分开。在分裂过程中，中心粒会移动到细胞的两极。因此在细胞分裂时，纤毛不会出现在细胞顶端膜上。如果细胞向外或向内分裂，分裂出去的细胞可能会死亡。
细胞密度的增加不能增加闭锁小带的完整性
在显微镜下，将IMCD3 分为4 种形态，4 种细胞群的排列方式皆不同，编号由小到大为细胞排列疏松到紧密。在前面的实验中，我们观察到IMCD3细胞株具有2 类细胞：具完整闭锁小带和具破碎闭锁小带。关于这2 类细胞的关系，我们推测有2 种可能：一是随着细胞生长、细胞密度增加，破碎闭锁小带可发育成完整闭锁小带，二是这个细胞株混合了不同特性的细胞群。为了分辨两种可能性，我们设计克隆形成实验，挑选单一性质的克隆。
以赫斯特染色染活细胞的细胞核，可看出4 个细胞株皆没有长出空腔。我们推论可能与细胞继代的次数有关，因为在原始的细胞株中仍能找到长空腔的IMCD3 细胞。
我们先确认微丝和闭锁小带的位置关系，发现具闭锁小带的细胞和不具闭锁小带的细胞之间的界线没有因为细胞密度增加而消失，反而更加明显。由这个实验我们推论闭锁小带不会因为细胞密度增加而改变原有的形态，所以这4 种形态的细胞可能是具不同特性的细胞群。
纤毛的生成和母亲中心粒有关
以绿色荧光标示纤毛蛋白，搭配红色荧光标示母亲中心粒，以便于活细胞追踪基体的移动及纤毛生成过程。将制作好的质体感染进细胞中，可以看到纤毛以母亲中心体为基底，向外长出纤毛。为了确认是否可以成功标示纤毛，以免疫荧光染色标记母亲中心体，确认位置。
结论与应用
本实验目前的初步结论如下。
??具完整闭锁小带的细胞通常同时具有纤毛。
??具完整闭锁小带的细胞，纤毛生长基部到细胞底端的距离较长，且纤毛生长在细胞顶端。
??具完整闭锁小带的细胞能形成立体的空腔构造，且分裂具有正确的方向性。
??细胞密度的增加不能增加闭锁小带的完整性。
??纤毛的生成和母亲中心粒确实有关。
闭锁小带如何影响细胞极性和纤毛生成呢？我们认为闭锁小带和细胞极性的关系可能和磷脂酰肌醇有关，已表现极性的细胞，其顶端细胞膜含有PIP2，基体可以辨別PIP2，而在顶端的位置长出纤毛，极性细胞的底端细胞膜则含有PIP3，这两类的磷脂酰肌醇分布受到闭锁小带的限制，不会相混。没有闭锁小带的细胞因为细胞膜上顶部和底部的磷脂酰肌醇位置同时混在细胞膜上，可能使基体无法分辨顶端，因而在细胞内长出纤毛。
目前的研究结果显示小鼠肾小管IMCD3 细胞株的纤毛形成和闭锁小带的形成有关联性。这个研究结果不仅对于了解纤毛的生成有帮助，也有助于找出纤毛突变所引发疾病的治疗方法。未来我们会运用活细胞影片实际拍出纤毛生成的过程，也会探讨母亲中心体、高基氏体和纤毛形成的关系，希望能更了解纤毛生成的路径及机制，提供治疗相关疾病的可能方向。
专家评语
细胞纤毛发育缺陷是多种疾病成因之一，但许多情况下其致病机理并不清楚，该项目以小鼠肾小管的细胞株为模型，探讨纤毛缺陷的致病机理。本项目证实具备完整闭锁小带的细胞通常同时具有纤毛，实验完整，有明确研究目的和显著创新。