大豆蛋白酶解过程中聚集行为及其聚集体结构

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大豆蛋白酶解产物拥有良好的溶解性、分散性、稳定性等理化性质,同时还具有多种生理功效,如抗氧化活性、降血压、降胆固醇、低抗原性以及免疫调节等,因此,大豆蛋白酶解肽具有诱人的开发前景。但是,酶解过程中的大豆多肽不可避免的会出现聚集现象,从而能导致溶液浑浊、可溶性多肽得率降低。本课题以大豆蛋白酶解过程为研究对象,系统的研究了大豆酶解多肽聚集体的形成规律及聚集体理化性质,并对聚集体的内部结构作初步探讨。大豆分离蛋白(SPI)的主要组分为11S球蛋白和7S球蛋白,本文首先以这三种蛋白为底物,分别考察了它们在酶解过程中多肽的聚集行为。研究发现11S酶解过程中多肽的聚集行为比较剧烈,SPI次之,而7S酶解产物则不会出现聚集行为。研究发现7S及其酶解产物对11S酶解过程中的聚集行为有抑制作用,并随水解度(DH)的增大抑制作用更为明显,另一方面,7S及其酶解产物的存在,对11S聚集体的进一步水解具有一定的抑制作用。然后,以酶促聚集比较明显的11S为研究对象,采用浊度法,研究了不同水解条件下的聚集行为。研究发现:1)蛋白酶种类对11S球蛋白聚集行为有影响,最易导致酶促聚集的是Alcalase,其次为木瓜蛋白酶,而胰蛋白酶、胃蛋白酶以及中性蛋白酶的酶促聚集作用最弱;2)蛋白浓度对聚集有影响,11S球蛋白浓度越高,聚集现象越明显;3)相同条件下酶解温度越高,聚集越明显;4)pH对聚集有一定的影响,在pH8.0条件下Alcalase导致聚集现象最明显。随后,对11S酶解产物中水溶性成分及聚集体的理化性质作了进一步研究。研究表明,在DH13%之内,酶解产物的平均粒径随水解度的增大逐渐增大。聚集体所占总蛋白的比例随水解度的增大先增大,在DH5%达到最大值(约占总蛋白的21%,w/w),进一步增大水解度,不溶性聚集程度减小。研究发现,可溶性部分中,肽段的分子量大于形成聚集体的肽段的分子量;SDS-PAGE表明聚集体主要由分子量小于6.5kDa的肽段聚集而成;可溶性成分的表面疏水性、疏水性氨基酸含量及C18柱加权保留时间均小于形成不溶性聚集体的肽段,这说明疏水相互作用是形成聚集的主要驱动力。最后,对巯基和链间二硫键在水解产物中的变化与分布进行了考察。研究发现,酶解液中总巯基(SH+SS)含量随水解度的增大而降低,可能生成了非二硫键形式的巯基氧化产物或者发生了脱巯基反应。研究发现聚集体中的总巯基含量高于可溶性部分。mBBr荧光标记电泳结果显示,聚集体和可溶性部分中均存在由链间二硫键链接的肽段,但是前者的分子量小于后者。通过对角线电泳与MALDI-TOF/TOF-MS联用分析,对聚集体和可溶性部分的肽段的来源进行了研究,发现前者肽段主要来源于11S的碱性B肽链,而后者主要来源于酸性A肽链。
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