RADA16-Ⅰ载氯化锂对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响研究

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目的:在治疗骨缺损的相关研究中,锂盐为近年来发现具有成骨作用的药物,本次研究旨在通过体外细胞培养模型分析锂盐是否具有对细胞的增殖及促进成骨的作用并探寻其作用的适宜浓度,再将该浓度下的锂盐与多肽水凝胶rada16-Ⅰ联合使用,探究这种培养方式对细胞成骨向分化能力的影响,是否较单独使用锂盐能达到更好的效果,为临床口腔种植或修复骨缺损提供一种新思路。方法:将MC3T3-E1细胞株离体培养8天,每天用CCK-8法记录细胞增殖情况并绘制相应生长曲线,为后续实验提供参考。将Li Cl浓度分为0mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L以及40mmol/L 5组,分别作用于细胞,观察3天内对细胞增殖速率的影响,作用5天后ALP(碱性磷酸酶)活性检测各浓度对细胞成骨能力的影响,选取其中对细胞增殖及成骨均有最大促进作用的浓度作为适宜浓度用于后续实验。将rada16-Ⅰ冻干粉溶于去离子水中,通过超声振荡使二者充分混合均匀后过滤除菌,配置成浓度为1%(W/V)的rada16-Ⅰ多肽水溶液,向其中加入少量PBS溶液使得多肽溶液自行转变为凝胶状的物质,液氮脆断后冷冻干燥制备电镜扫描样本对水凝胶进行形貌观察。选取前部分所得适宜浓度,对细胞分别加入负载适宜浓度Li Cl的rada16-Ⅰ、单纯加入适宜浓度Li Cl和不作任何处理,作用4天后提取m RNA对细胞成骨中特异性基因OSX、Runx2的表达量进行real-time PCR实验,分析负载Li Cl的rada16-Ⅰ与单独用Li Cl的处理方式对细胞成骨影响有无明显区别。结果:贴壁后的细胞外形上呈成纤维细胞样,生长曲线呈“S”型,接种后4-6天细胞增殖较快。通过CCK-8法对比不同浓度Li Cl处理细胞后的增殖能力,低浓度组5mmol/L和10mmol/L细胞数量较对照组增多,其中5mmol/L细胞数量最多,而20mmol/L以及40mmol/L细胞增殖受到抑制且细胞形态改变,40mmol/L现象尤为明显。ALP活性检测显示5mmol/L有较高的ALP活性,10mmol/L ALP活性与对照组相比无明显差异,20mmol/L和40mmol/L ALP活性均下降。通过PBS触发形成的水凝胶,流动性下降,呈无色透明,能维持一定形态,SEM制样观察水凝胶内部呈多孔样结构。提取经不同处理方式后细胞的m RNA进行real-time PCR分析,负载Li Cl的rada16-Ⅰ和单独使用Li Cl,OSX、Runx2的表达均比对照组高,且负载Li Cl的rada16-Ⅰ增高得较多,与单独使用Li Cl相比,差异有统计学意义。结论:Li Cl具有促进细胞增殖及成骨的能力,而多肽水凝胶rada16-Ⅰ作为生物支架负载Li Cl对细胞的增殖及成骨促进效果较单独使用Li Cl更佳。
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