【摘 要】
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目的:临床上牙根尚未发育形成的年轻恒牙发生牙髓坏死和根尖周炎为常见多发性疾病之一,由于年轻恒牙的牙根未完全闭合,若不及时治疗将导致患牙的牙根吸收、松动,甚至脱落。目前常用治疗手段多为根尖诱导术和根尖屏障术,但该治疗会导致牙根发育不足、冠根比例不协调等问题。近几年来,有学者研究表明人根尖乳头干细胞（Stem cells from apical papilla,SCAP）在根部牙本质的形成以及牙根硬组
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目的:临床上牙根尚未发育形成的年轻恒牙发生牙髓坏死和根尖周炎为常见多发性疾病之一,由于年轻恒牙的牙根未完全闭合,若不及时治疗将导致患牙的牙根吸收、松动,甚至脱落。目前常用治疗手段多为根尖诱导术和根尖屏障术,但该治疗会导致牙根发育不足、冠根比例不协调等问题。近几年来,有学者研究表明人根尖乳头干细胞（Stem cells from apical papilla,SCAP）在根部牙本质的形成以及牙根硬组织的再生发育过程中发挥重要作用,是修复根尖组织缺损的理想种子细胞。同时黄芩苷（Baicalin）也被证实是一类具有良好的消炎抑菌及促进细胞增殖和成骨分化作用的中药。因此,本研究旨在通过分析中药黄芩苷对人根尖乳头干细胞生物学特性的影响入手,初步探讨了不同浓度的黄芩苷药物联合人根尖乳头干细胞治疗年轻恒牙牙髓坏死和根尖周炎等疾病的可行性。方法:1、运用酶消化法从人牙根未发育完全的根尖牙乳头组织分离出SCAP,采用单克隆法获得纯化的SCAP,传代后获得稳定生长状态旺盛的细胞。应用流式细胞仪检测生长活力良好的第三代SCAP表面抗原STRO-1、CD146、CD90、CD45的表达量。经体外诱导分化SCAP14天、21天,利用碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色、茜素红染色、油红O染色,以证实获取细胞是否具备多向分化的潜能。2、选取第三代生长活力旺盛的SCAP,传代后计数接种于96孔板,隔天更换0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L不同黄芩苷浓度的DMEM完全培养基培养,运用MTT法检测第1、3、5、7、9天不同药物浓度的黄芩苷对SCAP增殖的影响。3、选取第三代生长活力旺盛的SCAP,分为普通培养基组（DMEM）和成骨诱导培养基组（ODM）,根据黄芩苷的不同浓度将实验组分为5个浓度实验亚组,依次为0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L,运用ALP染色法和ALP定量检测法研究不同药物浓度的黄芩苷对SCAP培养7天、14天早期成骨分化的影响;采用茜素红染色法和定量探究不同浓度黄芩苷对SCAP培养21天后成骨矿化的影响。结果:1、分离下来的根尖乳头组织块在培养瓶内培养5天后,倒置显微镜下可见细胞从组织块边缘游离爬出,同时观察到获取细胞呈长梭形;流式细胞仪检测得到所分离培养出的SCAP表达STRO-1、CD90和CD146,比率分别是14.73%,65.45%和61.63%,表达CD45比率为0.19%,呈阴性;SCAP在成骨诱导液体外诱导分化14天,ALP染色见细胞呈蓝紫色,SCAP在体外诱导分化21天时,茜素红染色见红色矿化结节形成;SCAP在成脂诱导液体外诱导21天后,油红-O染色见细胞胞浆呈红色脂滴形成。2、MTT检测结果显示,对照组和实验组中的各浓度细胞在第1天测得的OD值无明显差异（p>0.05）;自第3天起,黄芩苷药物浓度为50μmol/L、100μmol/L的实验组测得OD值均显著低于对照组（p>0.05）,表明含50μmol/L、100μmol/L黄芩苷药物浓度抑制SCAP的增殖活性;到第7天,黄芩苷药物浓度为20μmol/L的实验组与对照组比较,所测得OD值显著高于对照组（p<0.05）,表明20μmol/L的黄芩苷浓度组对SCAP的增殖起促进作用。3、ALP定量结果显示,ODM组诱导分化第14天时,20μmol/L浓度组的ALP活性明显高于对照组（p<0.05）,100μmol/L浓度组的ALP活性明显低于对照组（p<0.05）;DMEM组诱导14天后,20μmol/L浓度组的ALP活性明显高于对照组（p<0.05）;4、茜素红定量显示,ODM组中100μmol/L实验组的OD值明显低于对照组（p<0.05）。结论:1、本实验通过改良酶消化法成功分离人根尖乳头干细胞,并通过单克隆法、流式细胞术及体外诱导成骨、成脂验证SCAP具有多向分化的潜能。2、高浓度组的黄芩苷药物对SCAP的增殖表现抑制作用,低浓度组的黄芩苷药物对SCAP的增殖表现促进作用,其中以20μmol/L黄芩苷浓度组最为明显。3、20μmol/L黄芩苷药物浓度组可促进SCAP早期成骨分化,100μmol/L黄芩苷浓度组对S C A P的早、晚期成骨分化均为抑制作用。
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