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高级醇是葡萄酒中重要的风味物质,但含量过高会影响葡萄酒的风味和人体健康。本实验筛选出一株生长、发酵性能优良且高级醇生成量较低的出发菌株WY-1,将高级醇的氨基酸分解代谢途径(Ehrlich途径)和糖代谢合成途径(Harris途径)相关基因ILV2(编码α-乙酰乳酸合酶催化亚基)、ILV3(编码二羟酸脱水酶)、ILV5(编码乙酰羟酸还原异构酶)、ILV6(编码α-乙酰乳酸合酶调节亚基)、BAT2(编码细胞质支链氨基酸转移酶)和BAT1(编码线粒体支链氨基酸转移酶)进行敲除或者过表达,研究了改造这些基因对高级醇生成量的影响。(1)分析了 8 株葡萄酒酵母 WY-1,WY-2,WY-3,WY-4,WY-5,WY-6,VL1和QA23的高级醇生成量,并利用杜氏管发酵比较各菌株的耐受性,通过葡萄酒发酵比较各菌株的生长、发酵性能。结果表明WY-1高级醇生成量较低,为206.31 mg/L;且分别在乙醇体积分数16%、pH为2.65、葡萄糖浓度为400 g/L以及S02浓度为400 mg/L时都有很好的耐受性;生长速率较快、发酵性能较好,酒精度高于其他菌株,为11.01%(V/V)。筛选出了一株生长、发酵性能优良且高级醇生成量较低的出发菌株 WY-1。(2)针对Harris途径,分别对ILV2、ILV3和ILV5基因进行敲除,对ILV6基因进行过表达,获得了一系列重组菌株WY-V21、WY-V22、WY-V23、WY-V31、WY-V32、WY-V51、WY-V52、WY-V53和WY-V6。进行葡萄酒发酵,各重组菌株的生长、发酵性能均与出发菌株相差不大。发酵结果表明:与出发菌株WY-1相比,敲除ILV2三个等位基因的重组菌株WY-V23的正丙醇生成量提高了 38.46%,异丁醇生成量降低了 31.42%,异戊醇生成量降低了10.24%;敲除ILV3两个等位基因的重组菌株WY-V32的正丙醇生成量提高了 15.87%,异丁醇生成量降低了 22.76%;敲除ILV5三个等位基因的重组菌株WY-V53异丁醇生成量降低了 21.10%;游离过表达ILV6基因的重组菌株WY-V6的高级醇生成量没有差异。(3)针对Ehrlich途径,分别对BAT2和BAT1基因进行了敲除,获得了一系列重组菌株 WY-T21、WY-T22、WY-T11、WY-T12 和 WY-T22T11。进行葡萄酒发酵,敲除BAT1两个等位基因的重组菌株WY-T12的生长、发酵性能明显低于出发菌株,其他重组菌株与出发菌株相差不大。发酵结果表明:与出发菌株WY-1相比,敲除BAT2两个等位基因的重组菌株WY-T22的异丁醇生成量降低了 41.02%,活性戊醇生成量降低了 25.54%;重组菌株WY-T12正丙醇生成量提高了 37.57%,异丁醇生成量提高了 26.24倍,异戊醇生成量提高了 3.42倍,活性戊醇生成量提高了 2.61倍;敲除BAT2两个等位基因同时敲除BAT1 一个等位基因的重组菌株WY-T22T11正丙醇生成量降低了 19.52%,异丁醇生成量降低了 35.51%,活性戊醇生成量降低了 30.54%。