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目的:肢体缺血坏死是外周血管疾病(Peripheral arterial disease,PAD)致残的主要原因,外科治疗即使有效的重建肢体血流,缺血再灌注后的氧化应激反应也会加重组织损伤,术后患者肢体缺血反复发作也成为一大难题。骨骼肌纤维表面的骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cells,SKMSCs)具有干细胞性质。当肢体发生缺血损伤后,附着在肌纤维表面静息的肌卫星细胞被激活,增殖和成肌性分化,与附近受损的肌纤维融合并且形成新的肌管修复损伤。因此,减少氧化应激反应、促进损伤肌肉再生可能成为缺血肢体治疗的重要策略。原花青素(Proanthocyanidins,PC)具有强大的抗氧化和清除氧自由基作用。有研究表明原花青素通过减轻氧化应激损伤,从而减少细胞凋亡,保护各种器官免受缺血或缺血-再灌注损伤。然而,原花青素在肢体缺血中的作用及具体的分子机制尚不清楚。本文旨在探讨原花青素对低血清低氧状态下骨骼肌卫星细胞增殖和分化能力的影响,以及在肌肉损伤及修复中的作用。这可能为肢体缺血坏死的预防和治疗提供新的治疗策略。
方法:细胞部分:通过将人骨骼肌卫星细胞置于低氧(体积分数1%O2)、低血清(体积分数1%胎牛血清)环境中培养,从而模拟肢体缺血缺氧状态,以生理盐水组为对照组、2.5μg/ml或5μg/ml的原花青素作为实验组,于不同时间点观察细胞。在第0、1,2,3,4天应用CCK8法检测细胞增殖;于第1天收集细胞,应用流式细胞仪检测细胞周期;分别于第1天、第3天、第5天收集细胞,提取细胞总蛋白,应用Western blot法检测增殖相关蛋白、肌原性标志蛋白及通路相关蛋白的表达,并在第3天免疫荧光染色,于激光共聚焦显微镜下观察分化后肌管形态。为进一步明确P38-MAPK信号通路在细胞分化过程的作用,用P38-MAPK通路抑制剂SB203580干预骨骼肌卫星细胞后,应用Western blot法检测肌原性标志蛋白及通路相关蛋白的表达。动物部分:根据经典文献方法,即双重结扎并离断左侧股动脉的起点和远端分叉处,构建单侧后肢缺血的小鼠模型。对小鼠进行后肢缺血造模后,随机分为对照组和实验组(n=12),分别腹腔注射生理盐水及20mg/kg原花青素,取干预7天后小鼠的腓肠肌,用苏木精-伊红染色法观察小鼠肌肉再生,并用显微镜计数再生肌纤维占所有肌纤维的比例。
结果:低血清低氧状态下1,2,3,4天,不同质量浓度原花青素组增殖能力均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);低血清低氧第1天,不同质量浓度原花青素组增殖细胞核抗原蛋白表达水平均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);低血清低氧第1天,不同质量浓度原花青素组S期细胞数目均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);低血清低氧状态下第3,5天,不同质量浓度原花青素组肌原性标志蛋白表达均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);低血清低氧状态下第3天,不同质量浓度原花青素组肌管形成数目均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);不同质量浓度原花青素组间相比,差异均无显著性意义(P>0.05);低血清低氧第3天,原花青素组p-P38-MAPK信号通路蛋白的表达明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);生理盐水+P38-MAPK通路抑制剂组与原花青素+P38-MAPK通路抑制剂组差异无显著性意义(P>0.05);小鼠下肢缺血第7天,原花青素组缺血腓肠肌每横断面积内中央核肌纤维/总肌纤维明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。
结论:1.原花青素可促进低血清低氧状态骨骼肌卫星细胞增殖。2.原花青素可通过激活P38-MAPK信号通路诱导骨骼肌卫星细胞激活、肌原性标志蛋白表达和肌管形成,从而促进缺血损伤骨骼肌再生,修复受损肌纤维,发挥重要的保护作用。
方法:细胞部分:通过将人骨骼肌卫星细胞置于低氧(体积分数1%O2)、低血清(体积分数1%胎牛血清)环境中培养,从而模拟肢体缺血缺氧状态,以生理盐水组为对照组、2.5μg/ml或5μg/ml的原花青素作为实验组,于不同时间点观察细胞。在第0、1,2,3,4天应用CCK8法检测细胞增殖;于第1天收集细胞,应用流式细胞仪检测细胞周期;分别于第1天、第3天、第5天收集细胞,提取细胞总蛋白,应用Western blot法检测增殖相关蛋白、肌原性标志蛋白及通路相关蛋白的表达,并在第3天免疫荧光染色,于激光共聚焦显微镜下观察分化后肌管形态。为进一步明确P38-MAPK信号通路在细胞分化过程的作用,用P38-MAPK通路抑制剂SB203580干预骨骼肌卫星细胞后,应用Western blot法检测肌原性标志蛋白及通路相关蛋白的表达。动物部分:根据经典文献方法,即双重结扎并离断左侧股动脉的起点和远端分叉处,构建单侧后肢缺血的小鼠模型。对小鼠进行后肢缺血造模后,随机分为对照组和实验组(n=12),分别腹腔注射生理盐水及20mg/kg原花青素,取干预7天后小鼠的腓肠肌,用苏木精-伊红染色法观察小鼠肌肉再生,并用显微镜计数再生肌纤维占所有肌纤维的比例。
结果:低血清低氧状态下1,2,3,4天,不同质量浓度原花青素组增殖能力均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);低血清低氧第1天,不同质量浓度原花青素组增殖细胞核抗原蛋白表达水平均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);低血清低氧第1天,不同质量浓度原花青素组S期细胞数目均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);低血清低氧状态下第3,5天,不同质量浓度原花青素组肌原性标志蛋白表达均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);低血清低氧状态下第3天,不同质量浓度原花青素组肌管形成数目均明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);不同质量浓度原花青素组间相比,差异均无显著性意义(P>0.05);低血清低氧第3天,原花青素组p-P38-MAPK信号通路蛋白的表达明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);生理盐水+P38-MAPK通路抑制剂组与原花青素+P38-MAPK通路抑制剂组差异无显著性意义(P>0.05);小鼠下肢缺血第7天,原花青素组缺血腓肠肌每横断面积内中央核肌纤维/总肌纤维明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。
结论:1.原花青素可促进低血清低氧状态骨骼肌卫星细胞增殖。2.原花青素可通过激活P38-MAPK信号通路诱导骨骼肌卫星细胞激活、肌原性标志蛋白表达和肌管形成,从而促进缺血损伤骨骼肌再生,修复受损肌纤维,发挥重要的保护作用。