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研究目的：为了获得高产壳聚糖酶菌株，制备壳聚糖酶，为今后壳寡糖市场应用提供基础。研究背景和意义：壳聚糖是几丁质脱乙酰衍生物，存在于自然界虾壳、蟹壳和真菌细胞壁中。具有抗菌、抗肿瘤、提高免疫力等生物学活性。但由于其分子量很大，只能溶于某些酸性溶液，人体难以吸收，在开发应用上受到很大限制。壳寡糖是壳聚糖的降解产物，不仅具有壳聚糖的所有功能，并且分子量小，水溶性好，易被人体吸收，使其应用领域更加广泛。目前制备壳寡糖的方法包括化学法、物理法和生物法。前两者酸性过强、降解速度慢、产物聚合度不易控制、产物复杂，生物法条件温和、产率高、反应易控制、所得产物聚合度适中。壳聚糖酶是生物法的关键酶，但是目前壳聚糖酶存在酶活力不高、底物专一性不强的问题，所以如何获取高效的壳聚糖酶成为壳寡糖商业化生产致胜的关键。研究方法：壳聚糖酶仅来源于植物和微生物，利用微生物生产壳聚糖酶，具有很多优势，微生物易培养，易控制发酵产酶条件，从而缩短产品生产周期，保护植物资源。本研究采集吉林市松花江岸边土壤，通过壳聚糖诱导富集的方法，筛选到三株产壳聚糖酶的菌株，其中菌株QS7酶活力最高，经DNS法测定酶活力为32.8U/mL，鉴定为草酸青霉；经紫外诱变后，得到一株突变菌株QS7-6，其酶活力高达47.6U/mL，提高了45%；通过单因素实验、正交实验设计的方法优化了QS7-6的发酵产酶条件，得到最佳产酶培养基组成为1%胶体壳聚糖，0.1%MgSO4，0.06%酵母提取物，0.14%K2HPO4.3H2O,0.06%KH2PO4；最佳培养条件为：500mL锥形瓶中装液量100mL，接种5%孢子悬液，30℃，120r/min培养96h；在最适产酶培养条件下，菌株QS7-6培养96h的酶活力高达70.5U/mL。QS7-6产酶方式以外分泌为主，采用40%-90%饱和度硫酸铵分级盐析，通过强阴离子交换层析方法对菌株QS7-6发酵液中的壳聚糖酶进行分离纯化，得到一条SDS-PAGE呈单条带的酶ChiQ，分子量大小约为40kDa。采用LC-MS/MS对纯化的ChiQ进行鉴定，经胰蛋白酶酶解，肽段SALNKNYITNFSTLR与草酸青霉壳聚糖酶的部分氨基酸序列完全匹配。研究ChiQ的酶学性质表明，酶促反应的最适反应温度为50℃，最适反应pH值为5.0，金属离子Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+促进壳聚糖酶活力，Hg2+和Ag+明显的抑制壳聚糖酶活力，ChiQ的最适作用底物是胶体壳聚糖，能够降解壳聚糖粉末，但不能降解几丁质和葡聚糖。单因素实验优化酶促反应工艺条件为：50℃，pH5.0时，底物壳聚糖的浓度为6%，最适酶用量为66.7U/g壳聚糖，最佳酶解反应时间为8小时。牛津杯抗真菌实验表明酶解产物具有抗白假丝酵母菌的作用。结论：从自然环境中筛选到一株产壳聚糖酶的真菌，可以作为今后工业生产壳聚糖酶的优势菌株，为今后壳寡糖的生产提供基础。