研究背景:2007年日本医科大学Ohsawa[1]等研究发现氢气具有很强抗氧化性。这一发现,使氢气迅速成为了学术界的研究热点。目前,已经研究并报道分子氢对多种器官和组织的多种疾病具有较好的防护和治疗作用,对分子氢生物学作用的研究还在不断深入[2,3]。本实验室在对分子氢生物学作用的研究中率先发现,分子氢对电离辐射损伤有着较好的防护作用。目前已经发现并报道了分子氢对受照细胞、造血组织、心血管组织、生殖系统及整体动物等均有十分显著的防护效果[4-8]。在日本学者Ohsawa研究中,通过实验证实分子氢是通过选择性清除·OH和ONOO-来发挥其抗氧化作用。然而,随着对分子氢研究的不断深入,愈来愈多的实验结果已无法用单纯的选择性清除自由基来解释。多个研究提示,分子氢或许影响了机体某些信号传导通路或是基因的表达。那么,在电离辐射损伤防护当中,分子氢又是通过何种途径发挥其生物学作用呢?阐明分子氢发挥生物学活性的机制问题,会为其在生物医学领域的更广泛应用提供理论依据,并能促使其能好的向临床应用转化。因此,本研究主要围绕着分子氢在电离辐射损伤防护中的分子机制而开展。本课题主要分为三个部分。第一部分研究分子氢在无细胞体系中中和多种自由基的能力。第二部分研究以机体内重要抗氧化酶为研究对象,检测分子氢是否对其活性产生影响。第三部分探讨Nrf2/ARE信号通路在分子氢辐射防护效应中的作用。研究内容:1、分子氢对多种自由基的清除作用:通过不同的化学体系中分别产生不同的自由基,使用电子自旋共振技术检测加入分子氢之后各种自由基含量的变化。2、分子氢对机体重要抗氧化酶的影响:研究分子氢在无细胞体系中对抗氧化酶活性的影响;检测分子氢对L-02细胞内抗氧化酶活性的影响3、Nrf2/ARE信号通路在分子氢辐射防护效应中的作用:建立分子氢细胞辐射防护模型,明确防护效果。脂质体转染si Nrf2,观察干扰Nrf2后分子氢对电离辐射损伤的防护效果,对结果分析和讨论。实验方法:1、光照核黄素生成,使用ESR检测加入分子氢其含量的变化2、使用ESR检测加入分子氢后DPPH自由基含量的变化3、光照血卟啉产生单线态氧,利用ESR检测加入分子氢后单线态氧含量的变化4、使用比色法检测分子氢对多种抗氧化酶活性的影响5、L-02细胞给予4Gy和8Gy 60Coγ射线照射,检测给氢对照后细胞的凋亡率及细胞活力的影响,验证分子氢对L-02细胞的辐射防护作用6、使用Western blot检测分子氢对照后细胞Nrf2蛋白表达量的影响7、使用PCR检测分子氢对照后细胞Nrf2 m RNA表达含量的影响8、利用lipo2000转染si Nrf2干扰L-02细胞中Nrf2的表达,在RNA及蛋白水平检测转染效果9、干扰Nrf2后检测酶活性,探讨干扰Nrf2后分子氢对照后细胞抗氧化酶活性的影响10、干扰Nrf2,检测照后L-02细胞的凋亡情况和细胞活力,评价干扰后分子氢对细胞辐射损伤的防护效应。实验结果:1、在无细胞体系中产生多种自由基,使用ESR检测,加氢组与对照组自由基含量无明显差异,提示分子氢在无细胞体系中不能与其直接发生反应,对其无明显清除作用;2、在纯化的SOD及CAT溶液中直接通入氢气,检测分子氢对抗氧化酶的直接作用。结果提示,分子氢对酶活性没有直接影响。3、予以L-02 4Gyγ射线照射,照后24h,检测各个实验组细胞抗氧化酶活性的影响。结果提示:分子氢可以显著提高照射后细胞内SOD、CAT及GSH-PX的活性。4、予以L-02 4Gy和8Gyγ射线照射,照后24h,检测细胞凋亡情况和细胞活力,结果为:细胞凋亡率和细胞活力呈剂量依赖性变化,与照射组相比,加氢组能显著降低照后细胞凋亡率及提高照后细胞活力,证明分子氢可以防护电离辐射对L-02细胞造成的损伤;5、予以L-02 4Gyγ射线照射,照后4h提取细胞RNA,检测Nrf2 m RNA的变化,结果为:各组之间m RNA含量无明显差异;6、予以L-02 4Gy照射,照后6h提取总蛋白,检测Nrf2蛋白水平的变化,结果为:给氢组Nrf2蛋白量明显增加,提示分子氢可以激活Nrf2;7、lipo2000转染si Nrf2,结果为:Nrf2 m RNA和蛋白水平的表达均明显下调,转染效果良好;8、干扰Nrf2后,予以L-02 4Gy照射,照后24h检测抗氧化酶的活性,结果发现抗氧化酶的活性明显下降;9、干扰Nrf2后,予以L-02 4Gy照射,照后24h检测细胞凋亡率和细胞活力,结果为:分子氢对照后细胞凋亡率和细胞活力无明显影响,提示干扰后分子氢对辐射损伤的保护作用下降。讨论与分析:近年来,国内外的众多研究发现,分子氢对多种疾病具有十分显著的防治作用。本实验室在对分子氢生物学效应的研究中,率先发现并报道了分子氢对电离辐射损伤的防治作用。目前,对于分子氢的研究,大多数停留在效应层面,有关分子氢作用机制仍不清楚。在前期对分子氢研究的基础上,我们考虑通过以下方面来探讨分子氢的作用机制:1、研究分子氢在无细胞体系中中和多种自由基的能力。2、以机体内重要抗氧化酶为研究对象,检测分子氢是否对其活性产生影响。3、探讨Nrf2/ARE信号通路在分子氢辐射防护效应中的作用。经研究我们发现,在利用ESR对自由基含量的检测中,并未观察到加氢组自由基含量有明显变化,提示在无细胞体系中分子氢对所研究的自由基并无明显的清除作用。在对抗氧化酶的研究中,我们观察到分子氢与酶之间的直接相互作用并不能影响其活性。而分子氢可以显著提高照后L-02细胞内抗氧化酶的活性。在此基础上。我们对Nrf2信号通路进行了研究,发现分子氢可以明显上调照后细胞Nrf2的蛋白水平。进一步地,我们对Nrf2进行了干扰实验,观察到在干扰Nrf2之后,照后被分子氢上调的多种抗氧化酶不再升高,同时,分子氢对L-02的辐射防护效应也显著下降。这些结果提示,分子氢可能通过激活Nrf2/ARE信号通路发挥其防护辐射损伤的作用。结论:1、分子氢在无细胞体系中,对所检测自由基没有明显的清除作用;2、分子氢可以明显提高照后细胞抗氧化酶活性;3、Nrf2/ARE信号通路在分子氢防护辐射损伤中发挥着重要作用。