【摘 要】
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目的:主要探讨CD54+/rASCs载体复合物在体内成脂细胞效应的理想实现途径和基于低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）基因转染脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）构建血管化组织工程脂肪瓣的适宜技术方法,为目前临床上自体脂肪组织及脂肪干细胞移植修复软组织器官缺损及乳腺癌术后乳房重建提供实验依据与理论支持
【基金项目】
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国家自然科学基金项目,项目名称: Ginsenoside-Rg1调控乳腺脂肪来源干细胞促进自体脂肪移植成活及机制研究,项目合同编号:81560316,项目起止时间:2016/01/01-2019/12/31; 国家自然科学基金项目 ,项目名称:Ginsenoside Rg调控异体ASCs旁分泌功能促进糖尿病创面的修复及分子机制,项目合同编号:81760346,项目起止时间:2018/01/01-2
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目的:主要探讨CD54+/rASCs载体复合物在体内成脂细胞效应的理想实现途径和基于低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）基因转染脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）构建血管化组织工程脂肪瓣的适宜技术方法,为目前临床上自体脂肪组织及脂肪干细胞移植修复软组织器官缺损及乳腺癌术后乳房重建提供实验依据与理论支持。方法:1、体外细胞实验:将成年新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪组织分离提纯并进行培养,取生长良好的第3代兔脂肪干细胞（Rabbit Adipose Stem Cells,rASCs）消化后,分别进行成脂、成骨和成软骨诱导分化。利用免疫磁珠分选出高表达CD54+的rASCs并诱导成脂分化。通过重组慢病毒载体介导的绿色免疫荧光蛋白体外标记rASCs,按试验中确定的MOI值进行Ad-HIF-1α体外转染CD54+/rASCs,得到HIF-1α高表达的种子细胞（HIF-1α/CD54+/rASCs）并进行体外扩增。2、体内移植动物实验:将第3代CD54+/rASCs细胞与支架混合培养并检测支架生物相容性。将制好的细胞支架分为四组,分别为A组:HIF-1α/CD54+/rASCs,植入兔左前侧背部肌筋膜内;B组:CD54+/rASCs,植入兔右前侧背部肌筋膜内;C组:HIF-1α/CD54-/rASCs,植入兔右后侧背部肌筋膜内;D组:CD54-/rASCs,植入兔左后侧背部皮下肌筋膜内;细胞移植后12周取材获取移植物组织,进行组织学、基因及蛋白的检测。3、临床应用观察与疗效评价:通过脂肪来源基质细胞胶（Stromal Vascular Fraction Gel,SVFG）与自体富血小板纤维蛋白胶（Platelet-Rich Fibrin Gel,PRFG）联合治疗以及两者与自体结构性颗粒脂肪混合移植治疗的疗效、术后并发症的情况进行安全性与有效性的评估,并与传统治疗方法的病例进行对照。结果:1、经Ⅰ型胶原酶消化分离的原代rASCs培养后细胞能贴壁生长并形成典型的长梭形细胞,rASCs可诱导成脂、成骨、成软骨多向分化。磁珠分选第1代rASCs获得高纯度的CD54+/rASCs,CD54阳性表达率高达99.2%,分选后传至第3代CD54+/rASCs成脂诱导2周显微镜下可以看到绝大部分细胞都有脂滴聚集,油红O染色呈阳性;经检测分析表明,CD54+/rASCs、rASCs以及CD54-/rASCs成脂诱导2周后成熟脂肪细胞密度分别为（39.60±4.33）cell/mm2、（18.63±2.78）cell/mm2、（7.20±1.91）cell/mm2,脂滴含量分别为（3.82±0.55）U、（1.54±0.31）U、（0.65±0.20）U;差异均有统计学意义（P<0.01）。2、经免疫荧光蛋白慢病毒携带HIF-1α基因转染后的rASCs保持了良好的正常形态,并且细胞稳定性好,可连续传代。以感染复数值为50转染CD54+/rASCs继续培养3d、7d,酶联免疫吸附法检测培养上清液中细胞因子或生长因子的含量呈进行性升高,与未转染组比较,差异有统计学意义（*P<0.05,**P<0.05）。3、结果显示,四组新生组织瓣湿重、成熟脂肪细胞数、细胞内脂滴含量、微血管数,经统计学分析,A组与B、C、D三组比较,差异有显著性意义（P<0.01）,B组与C组,B组与D组,C组与D组比较,差异有显著性意义（P<0.01）。采用q-PCR以及免疫印迹技术对四组新生组织瓣内的细胞因子或生长因子进行定量分析,其mRNA以及蛋白在A组和C组为高表达,而在B组和D组为低表达,A组与B和D组比较,C组与B和D组比较,差异有显著性意义（*P<0.01,#P<0.01）;成脂分化相关基因PPARγ的mRNA检测结果表明,B组为高表达,而在A组和C组为低表达,B组与A、C、D三组比较,A组与B和D组比较,C组与B和D组比较,差异有显著性意义;而成脂分化相关基因C/EBPα和ADD1的mRNA检测结果表明,A、B、C组均为高表达,与对照组（D组）比较,A组与B、C、D三组比较,差异均有显著性意义（*P<0.01,**P<0.01,#P<0.01）。4、临床结果表明,SVFG经纯化后联合PRFG治疗各种难愈性创面,能显著促进其愈合速度、提高愈合质量、减少创面愈合后因瘢痕增生挛缩导致功能障碍的发生率;在治疗面部软组织凹陷畸形上,不仅能显著提高颗粒脂肪组织的存活率和远期疗效,减少液化坏死、囊肿、结节等术后并发症的发生率,还能大大提高患者的美容效果和满意度;治疗乳腺癌术后乳房重建、乳房发育不良或产后乳房萎缩变形,能显著提高颗粒脂肪组织的存活率,减少液化坏死、囊肿、结节等并发症的发生率。结论:HIF-1α基因修饰CD54+/rASCs后与类人胶原蛋白支架复合移植可构建出较大体积的血管化组织工程脂肪瓣,为脂肪干细胞广泛应用于组织工程、再生医学研究及其在临床上促进创伤修复、组织再生、器官重建提供可靠的理论依据。
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