【摘 要】
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目的针对继发性脑损伤中氧化应激及细胞凋亡这两种重要病理过程展开研究,通过观察内源性抗氧化核心调控枢纽Keap1/Nrf2通路通路及抗凋亡相关蛋白磷酸化Akt在脑出血急性期的表达变化,探讨其在脑出血继发性脑损伤中的作用机制,并通过抗氧化药物干预,观察抗氧化剂对上述通路的影响,评估抗氧化治疗在防治脑出血继发性损伤中的作用机制,为进一步探索脑出血药物干预靶点提供理论依据。方法采用自体血立体定向注射建立大
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目的针对继发性脑损伤中氧化应激及细胞凋亡这两种重要病理过程展开研究,通过观察内源性抗氧化核心调控枢纽Keap1/Nrf2通路通路及抗凋亡相关蛋白磷酸化Akt在脑出血急性期的表达变化,探讨其在脑出血继发性脑损伤中的作用机制,并通过抗氧化药物干预,观察抗氧化剂对上述通路的影响,评估抗氧化治疗在防治脑出血继发性损伤中的作用机制,为进一步探索脑出血药物干预靶点提供理论依据。方法采用自体血立体定向注射建立大鼠脑出血模型,分别于造模后2h、8h、24h、3d、5d、10d检测采用Realtime PCR技术、Western blot技术及免疫组织化学技术观察Keap1/Nrf2通路及其下游抗氧化酶,以及抗凋亡相关蛋白磷酸化Akt在m RNA、蛋白水平、组织原位的表达变化,并通过免疫荧光双标染色确定Keap1、Nrf2表达的细胞来源。分析上述指标在脑出血急性期的动态表达变化规律,并与相应时间点神经行为学评分及脑含水量进行相关性分析。利用自由基清除剂依达拉奉干预大鼠脑出血模型,与抗氧化治疗后3d行神经行为学评分及脑含水量测定,并采用小动物PET/CT检测血肿周围葡萄糖代谢率变化,脑组织切片行TUNEL染色,判定血肿周围细胞凋亡水平变化。采用Realtime PCR技术、Western blot技术及免疫组织化学技术观察依达拉奉对Keap1/Nrf2通路及抗凋亡相关蛋白磷酸化Akt表达水平的影响。结果Keap1在假手术组及出血后2h存在稳定一致的表达,出血后8h Keap1开始表达明显下降,并于出血后24h、3d逐渐降低,于3d、5d时表达维持在较低水平,至出血后10d,Keap1蛋白表达有所恢复,趋近假手术组水平;Nrf2的表达在出血后2h即有显著增高,并于出血后8h至24h保持在较高水平,呈逐渐升高趋势,出血后3d至5d,Nrf2逐渐降低,至出血后10d时,Nrf2表达趋近假手术组水平。免疫双标结果显示,脑出血大鼠周围脑组织中Keap1及Nrf2均有明显表达,Keap1与Neu N表达高度重合,而与GFAP和Iba1未见明显重合;Nrf2与Neu N亦呈高度重叠表达,而与GFAP和Iba1未见明显共定位表达,提示Keap1/Nrf2的表达主要集中在神经元。Realtime PCR提示,Keap1/Nrf2下游抗氧化酶中,HO-1、GSH、TRX及GST-α1表达均有不同程度升高。其中,HO-1表达上调最为显著,于出血后3d时达高峰,其表达量较假手术组增高达76倍。Western blot结果显示,HO-1蛋白与出血后8h开始表达量逐渐增高,于出血后3d时表达量达到高峰,出血后5d至10d HO-1表达量逐渐降低。相关性分析显示HO-1蛋白表达水平与脑出血大鼠脑含水量之间呈正相关。磷酸化Akt在假手术组各时间点及出血后2h均有较弱的表达,但在出血后8h开始其表达明显增高,出血后24h磷酸化Akt表达量继续逐渐增高,至出血后5d时表达水平达高峰。至出血后10d时,磷酸化Akt表达量仍处于较高水平。依达拉奉干预脑出血大鼠3d后,治疗组神经行为学及脑含水量较对照组均有有明显改善;PET/CT显示治疗组血肿周围脑组织平均r CMRglucs较对照组有明显提高,根据SUV值计算血肿周围脑损伤范围显示,治疗组脑损伤范围较对照组明显缩小;TUNEL染色阳性细胞计数显示治疗组平均阳性细胞比例较对照组明显减少。Realtime PCR结果显示,依达拉奉治疗组Nrf2及下游抗氧化酶中HO-1、TRX、GST-α1的表达较对照组均明显升高;Western blot及免疫组化显示,依达拉奉治疗组Nrf2、HO-1及磷酸化p-Akt蛋白表达较对照组均有明显升高。结论脑出血急性期内,Keap1/Nrf2通路及其下游抗氧化酶、抗凋亡相关蛋白磷酸化Akt早期激活,并随病程发展呈时间依赖性变化;抗氧化剂依达拉奉除直接清除出血后释放的ROS外,还可能通过激活内源性抗氧化及抗凋亡通路发挥脑保护作用。
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