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micro RNA(miRNA)能与特定基因结合,直接降解靶基因的m RNA或者抑制靶基因的翻译过程,在动植物体内发挥重要的调控作用。大量的研究表明,在动物睾丸组织中miRNA对睾丸的发育和成熟及精子发生过程发挥至关重要的作用。我们课题组前期经过测序分析已经证实miR-638在大白猪性成熟前后睾丸组织中差异表达;miR-638能够靶向精子相关抗原1(Sperm-associated antigen 1,SPAG1)基因,并对公猪睾丸支持细胞的凋亡有一定的影响。在这些基础上,本课题以miR-638为主要研究对象,探究miR-638对猪睾丸ST细胞生长的影响以及在猪精子发生过程中的作用,并探究相关分子调控机制。本课题主要研究结果如下:1.miR-638和靶基因SPAG1对ST细胞功能的影响通过合成miR-638 mimic和inhibitor分别来超表达miR-638和抑制表达miR-638。通过构建靶基因SPAG1的干扰片段SPAG1-si RNA来抑制表达SPAG1基因。通过流式细胞仪检测miR-638对ST细胞周期的影响,实验结果表明:超表达miR-638可以抑制ST细胞周期S期的比例,抑制ST细胞由G1期向S期的转化;抑制表达SPAG1基因同样也可抑制ST细胞周期S期的比例,抑制G1期向S期的转化。实验结果表明,miR-638和靶基因SPAG1对ST细胞的作用效果相似,说明miR-638通过靶基因SPAG1对ST细胞的细胞周期产生影响。通过MTT法检测了miR-638对ST细胞增殖的影响,实验结果表明:超表达miR-638可以显著抑制ST细胞增殖,抑制表达miR-638可以显著促进ST细胞的增殖。2.miR-638调控ST细胞生长的分子机制研究通过Q-PCR和Western blot实验检测miR-638对细胞周期调控相关基因的影响,实验结果表明:超表达miR-638能抑制ST细胞中c-MYC、CCNE1、CCND1和CDK4的表达水平;同样,抑制表达SPAG1抑制c-MYC、CCNE1、CCND1和CDK4的表达水平。通过Western blot检测miR-638和靶基因SPAG1对PI3K/AKT通路的作用,实验结果表明:超表达miR-638能够抑制ST细胞中PI3K和AKT蛋白质磷酸化水平,抑制表达miR-638能够促进PI3K和AKT蛋白质磷酸化水平;同样,抑制表达SPAG1可以抑制ST细胞中PI3K和AKT蛋白质磷酸化水平。3.SPAG1对细胞有丝分裂的影响通过免疫荧光实验检测了SPAG1蛋白在ST细胞核中的定位,实验结果表明:在细胞有丝分裂中期和末期,SPAG1蛋白与微管蛋白α-tubulin共定位,表明SPAG1可能通过调控纺锤体的组装来调控细胞有丝分裂过程,从而调控ST细胞的生长。