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第一部分人睾丸组织中环状RNA的测序与鉴定背景及目的:非编码RNA作为表观遗传调控的重要执行者之一,成为了基因表达转录及转录后水平重要的调控因素。circ RNA作为一类新发现的非编码RNA成为了近期转录物组研究的明星分子之一。基因表达及其表观遗传调控在精子发生中起到了至关重要的作用,其异常可能与不育及后代健康紧密相关。本部分我们对人睾丸组织中这一类新型内源性非编码RNA进行了初步的探索,为完善人睾丸组织非编码RNA种类,及研究其在精子发生中的可能作用及机制提供依据与基础。方法:Trizol法提取精子发生正常人睾丸组织总RNA,去除核糖体RNA,使用RNase R消化所有线性RNA后,构建c DNA文库,采用Illumina Hi Seq 3000测序平台,PE150测序模式进行高通量深度测序。测序结果中选取表达丰富(count值)不一、长度大小各异的circ RNA,根据所预测的序列起始位点及成环特点,使用NCBI/Primer-BLAST在线设计Divergent Primer进行q RT-PCR验证及circ RNA可变环化(alternative circularization)特性分析。使用RNase R消化处理睾丸组织RNA,q RT-PCR检测基因对应的circ RNA及m RNA在消化前后表达量变化。结果:在人睾丸组织中测序reads的count值大于等于1的circ RNA共计15996条,其中10792条为数据库circ Base至目前未收录的,为本次测序中新预测的circ RNA。产生这15996条circ RNA的宿主基因中,94.6%只能产生6个及6个以内的circ RNA。有1017个宿主基因是本次测序中发现可以成环的,且主要与精子发生、精子结构及精子功能等密切相关。同时构成这15996条circ RNA的序列70.6%为基因组中外显子序列。随机选取的55个circ RNA中,有22个是数据库circ Base中存在的circ RNA,33个是本次测序预测的新circ RNA。其中有30个能特异性的被扩增检测,包括19个数据库circ Base中存在的circ RNA和11个本次测序中新预测的circ RNA;有9个能被扩增检测但同时含有其他bp大小的条带非特异性扩增,包括3个数据库circ Base中存在的circ RNA和6个本次测序中新预测的circ RNA。而成功特异性验证的30个circ RNA包含了11个普遍表达基因的16个circ RNA和11个睾丸特异性基因的14个circ RNA。选取其中3个基因(STK31、RNF17、SAE1)所对应的circ RNA设计引物,成功的分析了环状RNA可变环化特性。对9个基因所对应的circ RNA及m RNA进行RNase R消化处理后,同一个基因的m RNA表达量显著性降低,而circ RNA表达量未见明显降低,反而个别基因(如HIST1H2BA、WDR26、TBL1XR1)的circ RNA表达量显著上调约4倍,显示了circ RNA高效的耐RNase R消化特性。结论:本研究在人睾丸组织中成功的预测和鉴定了circ RNA的存在,新发现了10000多条circ RNA及1000多个可以成环的宿主基因。且这些睾丸来源的circ RNA具有可变环化特性及耐RNase R消化特性。这些circ RNA有望成为新的男性精子发生表观遗传研究点。第二部分人睾丸来源环状RNA在精浆中的表达与特征背景及目的:精浆中存在丰富的游离m RNA及游离mi RNA,稳定性好,获取方便,能全面代表各生殖器官组织(睾丸、附睾、精囊腺、前列腺等)的基因表达信息,是潜在的男性生殖疾病无创性新分子诊断标记物,也是很好的生殖遗传表观遗传研究指标。对于新近报道的circ RNA,本部分实验以第一部分已经验证在人睾丸组织中表达的circ RNA为研究对象,分析其在精浆中的表达情况及基本特征,从而探索精浆游离circ RNA可能的研究前景。方法:收集精液参数正常男性的精液标本,分离精浆,提取RNA,q RT-PCR分析第一部分成功验证的circ RNA是否在精浆中表达。将精浆在室温条件下放置0 h、12 h、24 h后,检测circ RNA的表达量变化,探索精浆中circ RNA的稳定性。将孔径0.1 um滤膜过滤与30 k Da超滤离心柱超滤相结合,对未处理精浆、滤膜过滤后的滤液及滤膜洗脱液、上述滤膜过滤液再经30 k Da超率离心柱离心过滤的滤液及超滤膜洗脱液中circ RNA含量进行检测,分析其可能的存在形式。结果:选取第一部分成功验证中的20个睾丸来源的circ RNA,无论是普遍表达基因的circ RNA,还是睾丸特异性表达基因的circ RNA,都能在精浆中检测出来。室温条件下精浆放置0 h、12 h、24 h后,circ RNA的表达量没有明显的差异,显示了睾丸来源circ RNA在精浆中具有很好的稳定性。0.1 um滤膜过滤与30 k Da超滤离心柱超滤相结合过滤实验中,circ RNA大部分存在于0.1 um滤膜过滤后的滤液中,而将这一滤液再次经超滤离心柱过滤后,大部分circ RNA被超滤膜截留在样品浓缩管中。表明精浆中游离的circ RNA可能是与蛋白结合成复合物形式存在于人精浆中,两次过滤使得circ RNA/蛋白复合物得到浓缩和富集。结论:睾丸来源的circ RNA,包含普遍表达基因及睾丸特异性表达基因的circ RNA,能在精浆中被检测到,且具有很好的稳定性。其稳定性机制可能与circ RNA以circ RNA/蛋白复合物形式存在于精浆中,从而逃脱RNA酶降解有关。精浆中的circ RNA有望成为新型无创生物标志物运用于男性生殖生理及疾病研究中。