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水产及畜牧业面临着各类病害频繁发生的难题,抗生素是防治养殖病害的传统方法,但抗生素会导致生物安全性与环境污染问题。抗菌肽由于其独特的抗菌机理,使细菌不易对其产生耐药性,且因代谢速度快而不会在机体中产生有害残留,被认为是潜在的传统抗生素替代品。由于抗菌肽的人工合成成本较高,又很难直接从生物体内分离获得大批量抗菌肽,采用基因工程技术重组表达抗菌肽是目前最可行的抗菌肽制备途径。本研究利用抗菌肽NZ2114和pisL9K22WK的基因序列,构建了受FLD1启动子调控的抗菌肽重组表达载体,并分别转入Pichiapink酵母中,获得了能高效表达抗菌肽的基因工程菌株。与此同时,本研究还将经密码子优化的抗菌肽NZ2114转入莱茵衣藻的叶绿体基因组内,构建了利用叶绿体遗传系统表达抗菌肽的基因工程藻。具体研究结果如下:1.以甲醛脱氢酶启动子FLD1替换pPink-LC质粒中的醇氧化酶启动子AOX1,构建了可由氯化胆碱诱导的新质粒。并以此为基础,分别插入密码子优化过的抗菌肽pisL9K22WK基因和NZ2114基因,构建了FPLC和FNLC两个酵母表达载体。此外,还采用串联方式构建了含有α分泌信号肽的pisL9K22WK基因四串联酵母胞外表达载体αFPHLC和含有α分泌信号肽的NZ2114基因四串联酵母胞外表达载体αFNHLC。2.上述表达质粒分别电转化Pichiapink酵母,经PAD平板上筛选、PCR验证和甲醇诱导初筛,最终获得了能在细胞内高效表达抗菌肽基因pisL9K22WK和抗菌肽基因NZ2114的酵母工程菌PH6和NZ6,以及能在胞外高效分泌表达抗菌肽基因pisL9K22WK和NZ2114的酵母工程菌PIS3和NZ2114-9。3.为了避免使用甲醇诱导酵母表达外源重组蛋白时所带来了安全隐患及甲醇残留问题,本研究利用饲料添加剂氯化胆碱代替甲醇作为诱导物,探索酵母工程菌PH6和NZ6的发酵条件。抑菌实验结果均表明,氯化胆碱成功诱导PH6和NZ6表达出了抗菌肽pisL9K22WK及抗菌肽NZ2114,而基因工程酵母的细胞总蛋白对金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用。进一步对氯化胆碱诱导PH6及NZ6发酵产抗菌肽的最佳条件研究发现:氯化胆碱诱导PH6的最佳诱导浓度为1%(w/v),最佳诱导时间为120 h,而氯化胆碱诱导NZ6的最佳诱导浓度为2%(w/v),最佳诱导时间为72 h。4.根据莱茵衣藻叶绿体基因的密码子偏好性优化了抗菌肽NZ2114的基因,并构建了含有16s/psbA杂合启动子的莱茵衣藻叶绿体表达质粒p322-NZ;通过“基因枪法”将该质粒和表达壮观霉素抗性基因的辅助质粒p228共同转化衣藻叶绿体,经多次同质化筛选最终获得能成功表达抗菌肽NZ2114的基因工程藻株16。抑菌实验结果显示:工程藻16的细胞粗提液对金黄色葡萄球菌有明显的抑制效果,在24 h内均保留抑菌活性。Tris-Tricine SDS PAGE电泳结果表明,工程藻16的细胞粗提液在4 kDa处出现蛋白条带,与NZ2114的预期大小基本一致。本研究获得了能表达抗菌肽的Pichiapink酵母工程菌,探索了用氯化胆碱替代有毒甲醇进行重组抗菌肽诱导表达的新途径;构建了能利用衣藻叶绿体遗传系统表达抗菌肽的基因工程藻株,实现了抗菌肽NZ2114在莱茵衣藻内的有效表达,为抗病饵料藻的开发与应用打下了重要基础。