研究背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种常见的以关节组织慢性炎症为主要表现的系统性自身免疫性疾病。病变关节主要表现为炎症细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成以及由此导致的软骨和骨的损伤。临床表现为受累关节疼痛、肿胀、功能下降,病变呈持续、反复过程。RA发病呈全球分布,在我国的发病率为0.26-0.5%,可发生于任何年龄,随着年龄增加发病率也逐步增加。一般女性多发,发病高峰在45～50岁之间。RA病程缠绵、反复,致残率高,几乎所有的RA患者都有不同程度的关节功能丧失,由此带来严重的社会问题和经济负担。RA发病机制很复杂,目前普遍认为适应性免疫反应尤其是细胞免疫反应在RA发病中起着重要作用：自身抗原被滑膜细胞吞噬、加工、处理后,将抗原信息传递给并激T淋巴细胞,不仅可以使B细胞激活分化为浆细胞,分泌大量免疫球蛋白；而且活化的T淋巴细胞可以释放出多种可溶性介质,如白介素-1(interlukin-1, IL-1).肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)等,促进滑膜增生、诱导滑膜炎症,最终导致关节软骨大分子分解、关节结构破坏及纤维结缔组织增生。基于以上的机制研究,临床上也出现了多种针对适应性免疫系统的生物制剂,包括针对参与免疫反应的效应细胞、信号分子及重要炎性细胞因子的治疗,如TNF-a拮抗剂、IL-1受体拮抗剂等。其中TNF-a拮抗剂在临床应用最为广泛,但是多个随机对照临床试验表明约40-50%的RA患者使用一种TNF-a拮抗剂6个月并不能达到ACR50改善,提示我们之前的理论并不能完全解释RA的发病机制,而近来越来越多的研究证据显示天然免疫反应在RA发病中也具有重要作用,RA是天然免疫和获得性免疫反应共同作用的结果。RA具体病因及发病机制,特别是天然免疫反应在RA发病中的作用和机制尚未完全清楚。近年发现天然免疫细胞(NK、DC、γδT、NKT等)及其亚群亦参与机体的免疫调节,其中随着自然杀伤(Natural killer, NK)细胞表型和功能的深入研究,NK细胞在免疫调节中的作用愈来愈引起人们的重视。NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分,在抗病毒感染免疫、肿瘤免疫、移植排斥反应以及免疫调节中起着十分重要的作用。NK细胞的免疫作用,与其细胞表面受体的表达密切相关。迄今为止,已经发现的NK细胞受体有几十种,大致可分为三类：(1)自然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptor, NCR),包括NKp30、NKp44和NKp46。(2)C型凝集素样受体,如NKR-P1,NKG2D和CD94/NKG2A等。(3)免疫球蛋白超家族受体,如CD158a、CD158b等。这些受体按功能又可分为活化性受体和抑制性受体两大类,通过与配体以特定的模式结合,整合活化性信号和抑制性信号,从而调节NK细胞的活化和功能。研究发现NK细胞具有强大的细胞因子分泌功能,不仅调节天然免疫应答,而且参与调节获得性免疫应答,是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。NK细胞活化后能分泌多种细胞因子,引起自身和T、B淋巴细胞的增殖活化和细胞因子产生,从而激发更有效的适应性免疫应答。越来越多的证据表明,NK细胞通过分泌细胞因子和细胞间接触的形式发挥正向或负向的免疫学调节功能,在机体内环境稳定方面起重要作用,许多疾病(包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病等)的发生可能与NK细胞调节功能异常或丢失有关。NK细胞在自身免疫性疾病发病中的作用及其机制是目前研究的热点。虽然NK细胞在RA发病中的确切作用及机制仍未完全清楚,但已有许多研究提示NK细胞在RA发病过程中起着重要作用。早在二十世纪八十年代就发现RA患者外周血中NK细胞数量下降和杀伤功能受损。随后的研究陆续发现,NK细胞在RA发病中可能的作用机制包括：1、NK细胞分泌多种细胞因子参与RA发病。CD56bright NK细胞群在RA滑液中占主要优势,其可产生多种细胞因子,如TNF-α、IFN-γ、IL-10、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)等,可与T细胞、树突细胞(dendric cell, DC)一起参与适应性免疫反应的发生。NK细胞还可通过分泌IFN-r促进B细胞的活化和树突细胞的成熟来参与炎症反应。2、NK细胞同时也通过和其他细胞间的直接接触来参与RA发病。NK细胞能够提供T、B淋巴细胞的共刺激分子,如CD40L/OX40/CD70/CD86等分子；活化的NK细胞能够通过NKp30,NKp46和DNAM-1识别并杀伤未成熟的树突细胞；从RA患者关节滑液中分离出的NK细胞同单核细胞接触培养后可以促进单核细胞分泌TNF-a等细胞因子；体外实验表明NK细胞与RA成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)的细胞间接触能够刺激成纤维样滑膜细胞产生促炎细胞因子；最近有研究表明从RA患者关节滑液中分离的NK细胞能够诱导CD14+的单核细胞分化为破骨细胞,该过程依赖NF-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, MCSF),而后两者均表达于滑液NK细胞,表明NK细胞在RA骨破坏中起着重要作用。长期以来的研究表明,NK细胞并不是一个均一的细胞群体,根据表面标志和功能的不同,可以将NK细胞分为不同的亚群。例如,根据NK细胞表面CD56分子表达密度的不同,可将NK细胞分为CD56bright和CD56dim亚群。这两个细胞亚群在免疫应答的过程中发挥着不同的生物学功能：CD56bright细胞活化后可产生多种细胞因子,具有免疫调节功能但杀伤功能较弱；而CD56dim细胞只产生少量的IFN-γ,主要发挥自然杀伤和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。在NK细胞多种受体中,NKp44受体属于自然细胞毒性受体,其只表达于活化NK细胞表面,是NK细胞活化的主要标志受体。因此,NKp44+NK细胞亚群在疾病发生中的作用受到了更多的关注。NKp44+NK细胞是人NK细胞的一个亚群,其表型特征为CD56+NKp44+NK细胞。NKp44受体的配体的分子结构尚未明确,既往研究发现NKp44受体能够与流感病毒和副流感病毒表面的血凝素相结合。NKp44受体与其相应配体结合后能够有效地激活NK细胞,使其发挥细胞毒作用。既往关于RA患者NKp44+NK细胞的研究发现RA患者滑液中NKp44+NK细胞比例较患者外周血及健康对照明显升高,但NKp44+NK细胞在RA发病中的作用及其临床意义并不清楚。最近美国华盛顿大学医学院的Marina Cella等人在炎性肠病患者的研究发现,NKp44+NK细胞与传统的NK细胞功能有较大差别,其杀伤功能减弱,但其能分泌多种细胞因子。NKp44+NK细胞可以促进自身及其他免疫细胞聚集,促进淋巴细胞粘附,在炎症过程中发挥重要作用。Marina Cella等人还在炎性肠病患者粘膜相关淋巴组织鉴定了一种新型的NK细胞—NK-22细胞,它是NKp44+NK细胞一个亚型,同时表达趋化因子受体CCR6。研究发现,NK-22细胞能分泌多种细胞因子,如IL-22、IL-26、白血病抑制因子(leucocyte inhibitory factor, LIF)等通过作用于结肠上皮成纤维细胞,促进上皮细胞增生,起到限制炎症和保护粘膜的作用。IL-22是NK-22细胞分泌的最主要细胞因子,NK-22细胞发挥功能主要是通过分泌IL-22实现的。IL-22是IL-10细胞因子家族的一员,是由特殊的免疫细胞群诱导产生,包括NK-22细胞、NKT细胞、T细胞等。IL-22可诱导体内急性期反应蛋白和趋化因子及基质金属蛋白酶产生,可增强IL-1,TNF-a,IL-17等炎性细胞因子的致病作用。既往研究显示IL-22在RA发病中具有重要作用。研究发现,RA患者成纤维样滑膜细胞和巨噬细胞产生的IL-22,可以诱导成纤维样滑膜细胞增生及趋化因子的分泌,进而促进关节炎症；C57BL/6小鼠胶原诱导性关节炎(collegen-induced arthritis, CIA)模型血清中检测到持续高水平的IL-22；IL-22基因敲除小鼠对CIA易感性较野生型小鼠要低,表现为关节炎发生率和血管翳减少,且低表达IL-1p,IL-6,TNF-a和基质金属蛋白酶9 (matrix matalloproteinase-9,MMP9)。研究还发现IL-22体外能促进破骨细胞增殖,提示IL-22与RA骨质破坏有关。综合上述研究结果,IL-22与RA炎症及骨质破坏密切相关。我们课题组的初步研究发现,RA患者滑液及外周血确实存在NKp44+NK细胞亚群包括NK-22细胞,而健康对照外周血几乎不存在NKp44+NK细胞。NK-22细胞通过分泌IL-22在炎性肠病患者中发挥重要作用,而炎性肠病与RA同属于自身免疫性疾病,RA患者体内的NK-22细胞是否也可以通过分泌IL-22或者其他细胞因子进而在RA发病中发挥重要作用,目前还没有相关研究。本研究围绕RA患者外周血和滑液NKp44+NK细胞亚群,从以下三个方面论证了NKp44+NK细胞亚群在RA发病中的作用及其对疾病活动、病情和疗效判断的意义：1、通过检测RA患者外周血及滑液NKp44+NK细胞的表达及其细胞毒功能,并分析NKp44+NK细胞与疾病活动的相关性,探讨了NKp44+NK细胞检测的临床意义；2、通过研究NK-22细胞细胞毒功能、细胞因子分泌功能,及其分泌的细胞因子对RA成纤维样滑膜细胞增殖及趋化因子分泌的影响,探讨了NK-22细胞在RA发病中的作用；通过研究NK-22细胞与疾病活动的相关性,探讨了NK-22细胞对判断RA疾病活动及病情的意义；3、通过研究青藤碱制剂联合MTX治疗RA有效后NK-22细胞数量变化,分析治疗后NK-22细胞与DAS28的相关性,进一步探讨NK-22细胞对疾病活动和疗效判断的意义。综上所述,深入了解RA患者NKp44+NK细胞亚群功能特征,从而明确其在RA发生发展中的作用,对揭示疾病的发病机制和药物靶标、判断病情和药物疗效具有重要意义。RA属于祖国传统医学“痹病”范畴,因人体遭受风、寒、湿、热之邪的侵袭,气血为病邪阴闭而引起的疾病。以筋骨、肌肉、关节酸痛、麻木、重着、屈伸不利和关节肿大、灼热等为临床主要表现。其主要病机是气血痹阻不通,筋脉关节失于濡养,以祛风、除湿、舒筋活络为治疗大法。中医药治疗RA历史悠久,疗效确切,且不良反应相对较轻。青风藤具有祛风湿、通经络、镇痛、利小便之功效,用于治疗风湿痹痛、关节肿痛、麻痹瘙痒等。早在1000多年前,青风藤即开始应用于风湿性疾病的治疗。李时珍在《本草纲目》中称清风藤“主治风疾,治风湿流注、历节鹤膝……”。《本草汇言》言：清风藤,散风寒湿痹之药也,能舒筋活血,正骨利髓。其主要有效成分为青藤碱,现代药理研究显示,青藤碱具有良好的抗炎和抗风湿的作用。目前临床上有多种以青风藤为主要成分的中药制剂治疗RA取得了较好的疗效。清风痛胶囊也属于青藤碱制剂,具有祛风化湿、温经散寒、活血通络的功效,既往药理及临床研究显示对急、慢性炎症具有良好的抗炎镇痛效果。甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)属于缓解病情抗风湿药(disease-modifying antirheumatic drugs, DMARDs)的一种,是二氢叶酸还原酶抑制剂,通过阻止二氢叶酸还原为活化的四氢叶酸,使胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的合成原料耗竭,抑制DNA和RNA的合成,从而抑制细胞的增生和复制。MTX属于细胞周期特异性药物,主要作用于S期。MTX可抑制体液免疫和细胞免疫,是目前治疗RA的一线用药。MTX及青藤碱制剂(清风痛胶囊)治疗RA疗效肯定,且均可通过多种机制发挥作用,NK-22作为一种新发现的可能在RA发病中具有重要作用的细胞,MTX及青藤碱制剂(清风痛胶囊)是否可通过影响RA患者NK-22细胞途径发挥治疗作用,目前还没有相关研究。本研究采用QGP技术(QuantiGene Plex)检测NK-22细胞IL-22 mRNA、TNF-αmRNA含量,QGP结合了b-DNA (branched DNA)信号放大与Luminex xMAP液相芯片(liquid chip)平台,其优势是可直接从全血或细胞样本中检测mRNA表达,无需进行RNA提纯、反转录、PCR扩增,可以同时对极少量样本中的3-36个基因进行高通量定量,是目前比较先进的多基因定量检测技术。研究目的本研究为了证实NKp44+NK细胞亚群在RA发病中的作用及其对疾病活动和病情判断的意义,从三个方面研究了NKp44+NK细胞亚群的功能：1.研究RA患者外周血及滑液NKp44+NK细胞表达及其与疾病活动的关系。2.研究NK-22细胞功能,探讨NK-22细胞在RA发病中的作用及其对疾病活动和病情判断的意义。3.研究青藤碱制剂联合MTX对NK-22细胞影响,进一步探讨NK-22细胞在RA发病中的作用及其对病情和疗效判断的意义。方法1研究对象2009年10月至2010年3月就诊于南方医科大学附属南方医院中医风湿科门诊及住院治疗的RA患者35例,男性7例,女性28例,平均年龄(46.8±10.3)岁。活动期RA患者20例,男性4例,女性16例,平均年龄(48.1±10.8)岁,其中10例活动期RA患者获得滑液标本。缓解期RA患者15例,男性3例,女性12例,平均年龄(46.6±8.7)岁。健康体检人员20例,男性3例,女性17例,平均年龄(47±11.6)岁。2研究方法2.1 RA患者外周血及滑液NKp44+NK细胞表达及其临床意义流式细胞术检测健康对照外周血、RA患者外周血及滑液NKp44+NK细胞比例,同时检测NKp44+NK细胞细胞内穿孔素、粒酶B、IFN-γ表达。分析RA患者外周血及滑液NKp44+NK细胞比例与DAS28评分、抗CCP抗体、RF的相关性。2.2 RA患者外周血及滑液NK-22细胞功能研究2.2.1 RA患者外周血、滑液及滑膜NK-22细胞检测流式细胞术检测健康对照外周血、RA患者外周血及滑液NK-22细胞比例；免疫荧光鉴定RA滑膜NK-22细胞。2.2.2 NK-22细胞细胞毒功能检测流式细胞术分选NK-22细胞,体外悬浮培养两周。流式细胞术检测细胞纯度,同时检测NK-22细胞细胞内穿孔素、粒酶B、IFN-γ表达。2.2.3 NK-22细胞培养上清IL-22、TNF-α浓度及IL-22 mRNA、TNF-αmRNA检测,NK-22细胞比例与外周血及滑液IL-22、TNF-α浓度的相关分析ELISA检测NK-22细胞培养上清中IL-22、TNF-α浓度,QGP检测NK-22细胞IL-22 mRNA、TNF-αmRNA含量。ELISA检测活动期RA患者外周血及滑液IL-22、TNF-α浓度,分析NK-22细胞比例与IL-22、TNF-α的相关性。2.2.4 NK-22细胞培养上清对RA FLS增殖的影响不同稀释度NK-22细胞培养上清体外作用于RA成纤维样滑膜细胞,MTT法检测NK-22细胞培养上清对RA成纤维样滑膜细胞增殖影响。NK-22上清中加入IL-22抗体和TNF-α抗体,观察两种抗体对NK-22细胞上清促RA成纤维样滑膜细胞增殖作用的影响。2.2.5不同浓度rhIL-22对RA LS分泌MCP-1的影响ELISA检测不同浓度rhIL-22 (ng/ml, 10ng/ml)对成纤维样滑膜细胞分泌MCP-1的影响。2.2.6 NK-22细胞与RA疾病活动的相关研究分析RA患者外周血及滑液NK-22细胞比例与DAS28评分、抗CCP抗体、RF的相关性。2.3青藤碱制剂(清风痛胶囊)联合MTX对RA患者NK-22细胞的影响研究14例RA患者予口服清风痛胶囊+MTX：清风痛胶囊4粒／次,一日三次；MTX剂量7.5-15 mg,每周1次,口服,疗程12周。流式细胞术检测患者治疗后外周血NK-22细胞比例；分析治疗后NK-22细胞与DAS28的相关性。3统计学处理采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数士标准差(x±s)或中位数士四分位数间距(M±INQ)表示。正态分布计量资料两组间比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析,两两比较采用Bonferroni检验；非正态分布计量资料采用多重非参数检验或两样本非参数检验,相关分析采用Spearman相关分析方法,双侧P<0.05为差异有统计学意义。结果1 RA患者外周血及滑液NKp44+NK细胞表达及其临床意义活动期、缓解期RA患者及健康对照外周血NKp44+NK细胞比例分别为1.480%、0.540%、0.000%,活动期RA患者外周血NKp44+细胞比例高于缓解期和健康对照(x2=46.708,P=0.000)。10例活动期RA患者滑液NKp44+细胞比例为15.645%,高于自身外周血NKp44+细胞比例2.540%(z=-3.780,P=0.000)。NKp44+NK细胞表达低水平的穿孔素(0.08%)、粒酶B(0.34%)、IFN-γ(0.12%)。活动期RA患者DAS28评分、抗CCP抗体浓度、RF滴度分别为4.63、287.8U/ml、300.08IU/ml;10例有关节积液RA患者DAS28评分、抗CCP抗体浓度、RF滴度分别为4.95、359.4U/ml、238.68IU/ml活动期RA患者外周血NKp44+NK细胞比例与DAS28评分、抗CCP抗体呈正相关(r=0.777,P=0.000；r=0.967,P=0.000),与RF无相关性(r=-0.343,P-0.138)。滑液NKp44+NK细胞比例与DAS28评分、抗CCP抗体呈正相关(r=0.930,P=0.000；r=0.867,P=0.001),与RF无相关性(r=0.564,P=0.090)。2 RA患者外周血及滑液NK-22细胞功能研究2.1 RA患者外周血、滑液及滑膜NK-22细胞检测RA患者外周血NK-22细胞比例为0.690%,高于健康对照外周血NK-22细胞比例0.000%(z=-6.225,P=0.000)。10例活动期RA患者滑液NK-22细胞比例为4.165%,高于自身外周血NK-22细胞比例1.195%(z=-3.781,P=0.000)。免疫荧光发现RA滑膜组织存在NK-22细胞, NK-22细胞为NKp44+CCR6+双阳性细胞,红色和绿色叠加后荧光为黄色。2.2 NK-22细胞细胞毒功能检测流式细胞术分选2×104个NK-22细胞,共分选3次。细胞纯度>90%。NK-22细胞低表达穿孔素(0.07%)、粒酶B(0.26%)、IFN-γ(0.11%)。2.3 NK-22细胞培养上清IL-22、TNF-α浓度及IL-22 mRNA、TNF-αmRNA检测,NK-22细胞比例与外周血及滑液IL-22、TNF-α浓度的相关分析PMA和ionomycin刺激后NK-22细胞培养上清中IL-22、TNF-α浓度分别为(1293.971±345.048)pg/ml和(272.238±83.471)pg/ml。NK-22细胞IL-22 mRNA、TNF-a mRNA水平高于正常NK细胞(P<0.01)。活动期RA患者外周血TNF-α和IL-22浓度分别为(313.059±90.513)pg/ml、(5.34±1.614)ng/ml;滑液TNF-α和IL-22浓度分别为(681.245±65.996)pg/ml、(7.22±1.249)ng/ml。RA患者外周血NK-22细胞与外周血IL-22和TNF-α浓度成正相关(r=0.869,P=0.000；r=0.957,P=0.000),滑液NK-22细胞与滑液IL-22和TNF-α浓度成正相关(r=0.930,P=0.000；r=0.967,P=0.000)。2.4 NK-22细胞培养上清对RA FLS增殖的影响NK-22细胞上清(IL-22、TNF-α浓度分别为941.82pg/ml和368.1pg/ml)作用24小时即能刺激RA FLS增殖,且在一定范围内呈时间剂量依赖性。作用48小时,NK-22细胞上清1：2稀释组也能刺激RA FLS增殖。作用72小时和96小时,NK-22细胞上清1：4稀释组均能刺激RA FLS增殖。50ug/ml IL-22抗体和1.2ug/ml TNF-α抗体能够完全抑制NK-22细胞上清促RA FLS增殖作用。2.5不同浓度rhIL-22对RA FLS分泌MCP-1的影响1ng/ml rhIL-22和10ng/ml rhIL-22作用72小时均能促进RA FLS分泌MCP-1, 10ng/ml rhIL-22组RA FLS上清MCP-1浓度高于1ng/ml rhIL-22组(P<0.05)。2.6 NK-22细胞与RA疾病活动的相关研究活动期、缓解期RA患者及健康对照外周血NK-22细胞比例分别为0.805%、0.510%、0.000%,活动期RA患者外周血NK-22细胞比例高于缓解期和健康对照(x2=40.193,P=0.000)。RA患者外周血NK-22细胞比例与DAS28评分、抗CCP抗体成正相关(r=0.9757,P=0.000；r=0.717,P=0.000),与RF没有相关性(r=0.067,P=0.799)。滑液NK-22细胞比例与DAS28评分、抗CCP抗体、RF均成正相关(r=0.918,P=0.000；r=0.851,P=0.002；r=0.784,P=0.007)。3青藤碱制剂(清风痛胶囊)联合MTX对RA患者NK-22细胞的影响研究14例活动期RA患者治疗后NK-22细胞比例较治疗前下降(P<0.05)。RA患者治疗后NK-22细胞比例与治疗后DAS28评分呈正相关(r=0.836,P=0.000)结论1.RA患者外周血及滑液NKp44+NK细胞数量明显升高,细胞毒功能减弱。2.NKp44+NK细胞与RA疾病活动度和严重程度密切相关。3.RA患者外周血及滑液NK-22细胞数量明显升高,细胞毒功能减弱；RA滑膜也存在NK-22细胞。4.IL-22和TNF-α是NK-22细胞体外分泌的最主要细胞因子,NK-22通过分泌IL-22和TNF-a从以下几个方面参与RA发病：(1)NK-22细胞上清能刺激RA FLS增殖,在一定范围内呈时间、剂量依赖性。(2) rhIL-22能刺激RA MCP-1的分泌。5.NK-22细胞与RA疾病活动度和严重程度密切相关。6.青藤碱制剂联合MTX治疗有效后RA患者NK-22细胞下调,NK-22细胞可能对疗效判断也有一定意义。