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外泌体是由细胞分泌的一种纳米级的囊泡状小体，包裹着蛋白质、mRNA、microRNAs等生物活性物质，参与许多重要的生理、病理过程。本课题主要探讨外泌体穿梭miR-21对食管癌细胞生物学功能的影响及其与食管癌发病风险的关系。研究利用可视化研究手段捕获外泌体及其包裹的miR-21从供体细胞穿梭至受体细胞的过程，并通过系列生物学功能实验和分子生物学实验，探讨外泌体穿梭miR-21对食管癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力的影响，及其可能的作用机制。最后结合食管癌病例对照研究，分析外泌体穿梭miR-21与食管癌发病风险的关系。 一、食管癌细胞外泌体中miR-21在细胞间的传递 超速离心法提取EC9706细胞培养液上清中外泌体，用亲脂性膜染料DiI染料荧光标记后，应用UltraVIEW Vox活细胞激光共聚焦显微术追踪观察外泌体的运动。活细胞实时成像技术显示胞外的外泌体可以通过细胞膜进入到活细胞内。 研究进一步应用Cy3标记miR-21 mimics，瞬时转染供体细胞EC9706，收集培养上清以获得Cy3标记的外泌体穿梭miR-21，将其加入已处于对数生长期的受体细胞EC9706中分别继续培养3h、6h、24h，流式细胞仪获得受体荧光细胞的百分比即为外泌体穿梭miR-21的转移效率，采用qRT-PCR技术检测受体细胞及其培养上清中miR-21的表达水平。结果显示，含有外泌体的培养上清中Cy3-miR-21 mimics在3h、6h、24h时转移到受体细胞的效率分别为60.3％、82.6％和85.0％，qRT-PCR检测结果显示在各时间点转染组miR-21的表达水平均高于对照组，在受体细胞中平均倍数变化分别为1.49，1.41，2.08，而在受体细胞上清中分别是147.03，19.29，15.35，表明培养6h后大部分外泌体来源的miR-21 mimics被转移进入受体细胞。 应用不同浓度的GW4869处理对数生长期的细胞48h，qRT-PCR结果显示随着GW4869浓度的增加，细胞中miR-21的表达水平逐渐升高，培养上清中miR-21的表达水平显著降低，表明GW4869对外泌体miR-21的生成有抑制作用。 二、外泌体穿梭miR-21对细胞生物学行为的影响及其靶基因的识别 食管癌细胞株EC9706瞬时转染miR-21 mimics使其过表达miR-21，应用细胞增殖试验（EdU法）、流式细胞技术（Annexin-Ⅴ标记）、Transwell细胞体外迁移和侵袭试验分析过表达miR-21对食管癌细胞EC9706增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。结果显示过表达miR-21后EC9706细胞增殖能力提高、凋亡细胞数减少，与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)，转染组细胞的迁移和侵袭能力均明显高于对照组(P＜0.05)。 进一步建立稳定的供受体培养模型，通过转染供体细胞使其高表达miR-21，将其与受体细胞共培养24h后，观察供受体细胞间非接触性细胞交流对受体细胞生物学功能的影响，结果发现，肿瘤细胞外泌体穿梭miR-21对受体EC9706细胞的凋亡、增殖、迁移、侵袭作用均有影响，转染miR-21 mimics的肿瘤细胞外泌体能够抑制EC9706细胞的凋亡，促进细胞的增殖、迁移和侵袭能力，与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。表明miR-21可以通过外泌体携带进入受体细胞，进而促进食管癌细胞的增殖、抑制其凋亡，增加其体外迁移和侵袭能力。 为识别外泌体穿梭miR-21的调控机制，研究应用生物信息学技术预测与上述生物学功能相关的miR-21调控靶基因，并应用qRT-PCR和Western Blot技术分析预测靶基因的mRNA和蛋白水平。生物信息学技术预测与细胞增殖、凋亡等多种功能相关的PDCD4是miR-21调控的靶基因之一。QRT-PCR检测受体细胞PDCD4表达在实验组和对照组中未见明显差异，而Western Blot结果显示，过表达miR-21后受体食管癌细胞中PDCD4表达较对照组降低了86.4％，提示PDCD4可能是miR-21参与食管癌细胞增殖、凋亡及侵袭等生物学行为调控的靶标之一。 三、外泌体穿梭miR-21与食管癌发病风险的病例对照研究 招募67对食管癌病人和健康对照，按性别和年龄进行1∶1匹配，采集外周血，分离血浆，利用qRT-PCR的定量分析方法，以U6为内参基因，检测血浆中miR-21的表达水平，利用logistic回归分析血浆miR-21表达水平与食管癌发病风险的关系。结果显示，miR-21在病例组血浆中的表达水平较对照组高2.96倍，条件logistic回归分析表明其表达上调可增加食管癌的发病风险，提示血浆miR-21的上调可能成为食管癌高危人群筛检和食管癌诊断的候选生物标志。