论文部分内容阅读
[目的]:丙烯腈(AN)是石化工业中重要的合成单体,广泛应用于合成腈纶纤维、丁腈橡胶、工程塑料及合成树脂等。现已知急性AN中毒是以中枢神经系统损害为主要表现,长期接触仍然存在对神经系统的慢性潜在影响。虽然AN的毒性机制仍未完全明了,但氧化性损伤已经公认为其主要毒性作用,抗氧化剂可以减轻AN的毒性作用。本实验以姜黄素(Curcumin,CUR)、水溶性维生素E(Trolox)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)分别代表三类抗氧化剂,旨在从细胞活力、细胞毒性、脂质过氧化、抗氧化能力、活性氧生成及线粒体功能六方面比较三类抗氧化剂在不同浓度及不同处理方式下(预处理和后处理)对AN介导的大鼠星形胶质细胞(AST)神经毒性的预防和保护效果的差异,通过干扰转录因子NF-E2相关因子(Nrf2),确认保护作用机制。
[方法]:取出生1~2天SD大鼠作大脑皮质星形胶质细胞(AST)的原代培养。细胞处理方式:预处理组分别先用CUR(2μM和5μM)、Trolox(5mM和10mM)和NAC(2.5mM和5mM)对细胞处理4小时,然后用AN(2.5mM)染毒24小时;后处理组先用AN(2.5mM)对细胞染毒24小时,然后再分别用CUR(2μM和5μM)、Trolox(5mM和10mM)和NAC(2.5mM和5mM)对细胞处理4小时。细胞处理后对各个指标进行测定来评价AN介导AST的氧化应激损伤及线粒体损伤:细胞活力及毒性检测(MTT活性和乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率);细胞经AN染毒后的氧化应激指标(丙二醛(MDA)及还原性谷胱甘肽(GSH)含量);细胞内活性氧(ROS)生成的测定;线粒体功能的评价指标(线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential),三磷酸腺苷(ATP)含量以及细胞经Mito-trackerred染色后通过荧光强度来检测线粒体数量);此外还通过脂质体转染干扰Nrf2后,进行三类抗氧化剂对AN损伤的AST不同处理方式之间细胞活力及毒性的保护作用的比较。
[结果]:AST经AN染毒24小时后,AN组与空白组相比,细胞活力显著降低(P<0.05);LDH漏出显著升高(P<0.05);脂质过氧化产物MDA显著升高(P<0.05);细胞内GSH含量显著降低(P<0.05);细胞内ROS含量显著升高(P<0.05);线粒体膜电位显著降低(P<0.05);细胞内ATP含量显著降低(P<0.05);细胞经Mito-trackerred染色后线粒体红色荧光强度显著降低(P<0.05)。在预处理组中,CUR在两个浓度下与AN染毒组相比均能显著的改善由AN介导的AST活力的降低(P<0.05),提高细胞内GSH含量(P<0.05)、线粒体膜电位水平(P<0.05)、细胞内ATP含量(P<0.05)以及经Mito-trackerred染色后线粒体红色荧光强度(P<0.05),降低AN引起的细胞内LDH的漏出(P<0.05)及脂质过氧化作用(P<0.05)并减少细胞内活性氧的产生(P<0.05),从而有效的缓解AN介导的AST氧化应激及线粒体功能损伤。高浓度NAC对AST的保护作用比其在低浓度时明显。而Trolox在两个浓度下对AN介导的AST氧化应激损伤的保护作用并不明显。在后处理组中,Trolox在两个浓度下与AN染毒组相比均能显著的改善由AN介导的AST活力的降低(P<0.05),提高细胞内GSH含量(P<0.05)、线粒体膜电位水平(P<0.05)、细胞内ATP含量(P<0.05)以及经Mito-trackerred染色后线粒体红色荧光强度(P<0.05),降低细胞内LDH的漏出(P<0.05)及MDA水平并减少细胞内活性氧的产生(P<0.05),有效的提高细胞的抗氧化能力。NAC处理同样能够显著改善由AN介导的AST的氧化应激损伤(P<0.05)。然而CUR在此处理方式下对AN介导的AST氧化应激损伤的保护作用并不明显。此外通过脂质体转染干扰Nrf2表达后比较三类抗氧化剂对AN损伤的AST不同处理方式之间细胞活力及毒性发现,CUR及Trolox预处理组AST活力与后处理组相比有显著性意义(P<0.05),而NAC处理组对细胞的保护作用在两种方式之间的差异并不明显。
[结论]:CUR预处理对AN介导的神经毒性有较好的保护作用,而CUR后处理所显示的治疗效果并不明显。Trolox后处理能够对AN介导的神经毒性有较好的治疗作用,而Trolox预处理所显示的预防效果并不明显。NAC在两种处理方式下均有一定的保护作用,提示NAC对AN介导的神经毒性既有预防作用同样也有一定的治疗作用。预处理和后处理的作用差异可能与激活Nrf2-ARE信号通路有关。因而在选择抗氧化剂进行神经保护时应注意抗氧化物的作用机制及给予时机。