【摘 要】
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目的我们选择能定时使病毒特异性感染皮层兴奋性神经元细胞的转基因工具鼠Ca MKIIα-Cre ER,利用内皮素颅内注射建立稳定的运动皮层脑梗死小鼠模型,并观察脑梗死小鼠大脑健侧皮层神经元的重塑情况。通过在脑梗死小鼠健侧皮层植入转录因子Fezf2将健侧皮层胼胝体投射神经元重编程为皮质脊髓投射神经元,观察脑梗死小鼠的运动功能恢复情况。方法1.脑梗死健侧皮层神经元可塑性检测:取6-10月龄的小鼠随机分为
【基金项目】
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项目名称:转录因子 Fezf2 重编程皮层投射神经元重建脑梗死小鼠神经网络的研究,项目合同编号:81760217,项目来源:国家自然科学基金地区项目,项目起止时间:2018.01-2021.12； 项目名称:转录因子 Fezf2 重编程皮层投射神经元以促进脑梗死小鼠运动功能修复的研究,项目合同编号:2017GXNSFAA198135,项目来源:广西自然科学基金项目
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目的我们选择能定时使病毒特异性感染皮层兴奋性神经元细胞的转基因工具鼠Ca MKIIα-Cre ER,利用内皮素颅内注射建立稳定的运动皮层脑梗死小鼠模型,并观察脑梗死小鼠大脑健侧皮层神经元的重塑情况。通过在脑梗死小鼠健侧皮层植入转录因子Fezf2将健侧皮层胼胝体投射神经元重编程为皮质脊髓投射神经元,观察脑梗死小鼠的运动功能恢复情况。方法1.脑梗死健侧皮层神经元可塑性检测:取6-10月龄的小鼠随机分为两组:假手术组（n=12）,实验组（n=12）。利用内皮素颅内注射建立小鼠局灶性脑梗死模型,假手术组仅接受PBS注射。在脑梗死第0天、脑梗死后第5天、第15天及第20天分别取脑进行GAP-43免疫荧光染色（各时间点n=3）,观察不同时间脑梗死健侧皮层GAP-43的表达情况2.脑梗死小鼠健侧皮层投射神经元重编程改变:取6-10月大Ca MKIIα-Cre ER工具小鼠接受内皮素颅内注射后随机分为两组:腺相关病毒空载对照组（n=6,注射空载病毒）,腺相关病毒Fezf2过表达组（n=6,注射Fezf2过表达病毒）。内皮素注射后第6天注射于健侧皮层注射病毒,病毒充分表达4天后连续5天腹腔注射他莫昔芬油溶液。我们分别于病毒注射后第14天和第28天取脑和脊髓进行免疫荧光染色检测重编程神经元分子标记物及投射路径（各时间点n=3）。3.行为学实验评估脑梗死小鼠运动恢复情况:选用6-10月大雄性Ca MKIIα-Cre ER工具小鼠作为实验对象,随后连续3天进行运动行为学训练（网格错步实验、转棒实验及平衡木实验）,并于建立脑梗死模型前1天记录他们的行为学数据。利用内皮素颅内注射建立小鼠局灶性脑梗死模型,假手术组仅接受PBS注射。对造模成功的小鼠随机分为三组:脑梗死对照组（n=8,仅注射内皮素）、腺相关病毒空载对照组（n=8,注射内皮素及空载病毒）、腺相关病毒Fezf2过表达组（n=8,注射内皮素及过表达病毒）,同时再加上假手术组（n=6,仅注射PBS）,我们最终选用这四组小鼠进行实验。术后第6天,我们对腺相关病毒空载组和腺相关病毒Fezf2过表达组的小鼠健侧皮层注射腺相关病毒。待病毒于脑内充分表达4天后,我们对小鼠连续5天进行腹腔注射他莫昔芬油溶液启动Cre入核表达。通过运动行为学测试（网格错步实验、转棒实验及平衡木实验）测定各组小鼠脑梗死后第5天、第15天、第25天、第35天及第45天的运动能力变化情况。结果脑梗死后第5天开始健侧皮层的GAP-43表达升高,并且能维持至脑梗死后第20天;脑梗死大脑健侧皮层注射过表达病毒Fezf2后,胼胝体投射神经元标记物CUX1的表达在注射过表达病毒第14天和第28天未发生改变,而皮质脊髓投射神经元标记物CRYM的表达在第14天和28天时表达增多;与空载病毒组相比,健侧皮层注射过表达病毒第28天时健侧皮层神经元胼胝体及同侧纹状体投射纤维减少,皮质下的颈髓前角处可见纤维投射;在行为学实验中,网格错步实验发现脑梗死健侧皮层注射病毒后第29天开始腺相关病毒Fezf2过表达组小鼠患侧上肢的错步率较腺相关病毒空载对照组小,而平衡木实验和转棒实验未发现这两组间有差异。结论1.小鼠脑梗死后第5天开始,大脑健侧皮层GAP-43的表达增多,存在神经重塑,脑梗死后大脑健侧皮层神经元具有可调控性。2.Fezf2在脑梗死健侧皮层Ⅱ/Ⅲ层神经元过表达第14天和第28天,神经元重编程获得了新的分子身份,皮质脊髓投射神经元标记物CRYM表达升高,同时重编程神经元的投射路径也发生了改变,纤维投射至皮质下的颈髓。3.Fezf2在脑梗死健侧皮层Ⅱ/Ⅲ层神经元过表达29天,脑梗死小鼠的患侧上肢精细运动功能得到改善。
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