目的和意义:脑梗死是神经系统疾病中发病率、致残率和死亡率最高的疾病。然而,针对脑梗死的主要治疗手段是静脉溶栓,但是严格的治疗时间窗和副作用致使患者收益率极低,因此脑梗死恢复期治疗至关重要。GUCY1A3基因编码可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanosate cyclase,s GC）的α1亚基,参与构成的α1/β1异二聚体是血管内皮细胞中s GC最主要活性形式。s GC是一氧化氮（nitric oxide,NO）的唯一受体,通过NO-s GC-c GMP参与大量的生理过程,包括神经传递、血管平滑肌舒张和抑制血小板聚集等。众多研究表明,临床上脑梗死患者病灶周围缺血半暗带血管新生情况与患者生存率和预后恢复密切相关。值得注意的是,基础研究表明GUCY1A3基因在内皮细胞上有广泛表达,氧诱导视网膜病变模型显示缺乏GUCY1A3基因编码蛋白会造成新生血管减少,选择性s GC抑制剂会抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管新生。但是目前尚未有关于GUCY1A3基因可能通过调控脑梗死后血管新生介导神经功能恢复的研究。基于上述研究结果,现本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建GUCY1A3基因突变并能稳定遗传的小鼠基因敲除纯合突变体模型,并在其基础上构建小鼠永久性局灶性脑缺血模型（permanent middle cerebral artery occlusion,p MCAO）,通过Longa分级法评分、TTC染色和CD31、VEGFA免疫荧光染色观察GUCY1A3基因敲除对小鼠脑梗死后血管新生、神经功能恢复的影响,为促进血管新生有助于脑梗死治疗这一潜在策略奠定基础。方法:1、利用常用数据库和软件对人类和小鼠GUCY1A3基因进行生物学信息分析,对比两者的碱基序列和编码氨基酸序列同源性。2、通过选择正确的打靶位点、构建载体和敲除效果鉴定、sgRNA和Cas9 mRNA体外转录合成、小鼠受精卵显微注射和移植、突变体筛选繁育等构建基于CRISPR/Case9基因编辑技术的小鼠GUCY1A3基因敲除模型。3、利用小鼠p MCAO、Longa分级法评分、TTC染色、免疫荧光染色等技术观察GUCY1A3基因敲除对小鼠脑梗死后血管生成及神经功能恢复的影响。结果:1、人和小鼠的GUCY1A3基因,具有高度同源性,且在重要功能结构域高度保守。2、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术能获得稳定遗传的缺失13个碱基引起无义突变的基因敲除纯和突变模型。3、p MCAO术后96h,GUCY1A3-/-小鼠相较于野生型小鼠:Longa分级法评分高,脑梗死体积大,脑梗死周围区域CD31、VEGFA免疫荧光表达量低,且新生血管内皮细胞与VEGFA存在共定位的数量少。结论:1、基于CRISPR/Cas9基因编辑技术能够对小鼠GUCY1A3基因敲除并获得稳定遗传的纯合突变体模型。2、GUCY1A3基因敲除抑制小鼠脑梗死后血管新生及神经功能恢复。3、GUCY1A3基因可能通过调控脑梗死后血管新生影响神经功能恢复,是脑梗死治疗的潜在靶点。