小贯小绿叶蝉Empoasca onukii（Matsuda）（即“假眼小绿叶蝉”）是茶树上最重要的害虫之一。由于该虫寄主广泛、适应能力强、每年发生代数多等特点,给茶叶生产造成巨大损失。目前,生产上防治小贯小绿叶蝉的仍然以化学防治为主,但化学药剂的不合理的滥用,导致其抗药性不断升高。噻虫嗪是一种烟碱类杀虫剂,具有触杀、内吸、胃毒活性,且杀虫谱广,是防治小贯小绿叶蝉的主要化学药剂。已有的研究表明,小贯小绿叶蝉对噻虫嗪的抗药性呈逐年增加趋势。评价小贯小绿叶蝉对噻虫嗪的抗性机制是制定抗性治理对策和开发杀虫剂的重要依据。因此,本文以室内驯化获得的抗敏品系为材料,从生命表构建、抗敏品系筛选、酶活测定、转录组学与抗性基因的扩增和原核表达等方面,探究了小贯小绿叶蝉对噻虫嗪产生抗药性生化及分子机制,主要结果如下:1.构建了云贵高原小贯小绿叶蝉生命周期表并筛选了抗敏品系本研究结果表明:成虫的龄期最长,为18.90 d,其次为卵9.02 d,1-5龄若虫的龄期分别为1.28 d、1.92 d、2.12 d、2.78 d、1.37 d。小贯小绿叶蝉的年龄-阶段特定存活率（Sxj）曲线之间存在明显的重叠;随着时间的增加,小贯小绿叶蝉的年龄-特定存活率（lx）在31 d时开始出现下降,44 d时所有个体均死亡;年龄-特定生殖力（fx）、年龄-特定生殖力（mx）曲线均呈现先升高后降低趋势;年龄-阶段期望寿命（exj）随着年龄的增加而呈现逐渐降低;小贯小绿叶蝉雌虫一个初生卵的生殖价值（vxj）为1.065,随着年龄和龄期的不断延长,其生殖价值亦随之增高,当到了第10天时,雌虫产卵时的生殖价值达到顶峰。抗敏品系筛选结果显示:小贯小绿叶蝉敏感品系在24 h、48 h、72 h毒力回归方程分别为y=4.2952+1.6306x、y=4.6528+1.9017x、y=5.0957+2.0957x,相关系数分别为:0.9982、0.9705、0.9362;致死中浓度LC50分别为2.7055 mg/L、1.5226mg/L、0.8971 mg/L。抗性品系连续筛选15代后,LC50上升至52.4806 mg/L,为初始LC50的19.40倍,达到中抗水平。2.探明了小贯小绿叶蝉抗噻虫嗪的生化机制增效醚（PBO）、顺丁烯二酸二乙酯（DEM）以及磷酸三苯酯（TPP）对小贯小绿叶蝉敏感品系的增效比依次为1.4115、1.2251、0.8911,而在抗性品系中增效比依次为3.0153、2.8508、1.010,结果显示,PBO和DEM在小贯小绿叶蝉抗性品系中的增效作用明显,与之相较,TPP增效作用一般。小贯小绿叶蝉敏感品系和抗性品系处理组,多功能氧化酶（MFO）的活力分别为0.2977mmol/pro（mg）/30 min与1.9707mmol/pro（mg）/30 min,两者之间差异显著,抗性品系的多功能氧化酶（MFO）的活性为敏感品系的6.62倍;谷胱甘肽S-转移酶（GST）的活力分别为33.3337 U/mg prot与182.2680 U/mg prot,单因素方差分析结果显示,两者之间差异显著,抗性品系的谷胱甘肽S-转移酶（GST）的活性为敏感品系的5.47倍;乙酰胆碱酯酶（Ach E）的活力分别为0.2934nmol/min/mg prot与0.3002 nmol/min/mg prot,经单因素方差分析,结果显示两者之间差异不显著,抗性品系的乙酰胆碱酯酶（Ach E）的活性为敏感品系的1.02倍。3.阐明了小贯小绿叶蝉抗噻虫嗪的分子机制通过对小贯小绿叶蝉抗敏品系的转录组进行分析,共计得到222059个unigenes,在七大数据库中注释比对中,其中有7844条unigenes成功注释到所有数据库,有107653条unigenes至少成功注释到一个数据库。此外,仍有114406条unigenes未能成功注释,这部分unigenes序列的作用和功能尚有待进一步挖掘和分析。通过Blastx比对,共获得编码蛋白质的核酸序列（CDS）67224条;经estscan预测,共获得编码核酸和氨基酸的序列（CDS）56437条。基于阈值pval<0.01,fold change≥2对处理组和对照组之间的差异基因进行筛选,共获得差异unigenes 3131个,其中显著上调169个,显著下调1423个。3131个差异unigenes中,共计1598个成功的注释到GO数据库三大类三十个功能组,其中生物学过程大类中以蛋白质水解、氧化还原过程功能组unigenes个数最多,分别为138个、139个;分子功能大类中unigenes数目较多的功能组分别为作用于L-氨基酸肽的肽酶活性（unigenes数142个）、肽酶活性（unigenes数144个）、内肽酶活性（unigenes数102个）、氧化还原酶（unigenes数137个）、水解酶活性（unigenes数296个）,说明小贯小绿叶蝉对噻虫嗪的抗性在生物学方面表现为体内细胞不同代谢活动的进行,主要与细胞中的结合抑或催化活性等功能相关。上调差异表达unigenes中共有11个unigenes与抗药性相关,主要包括细胞色素氧化酶、谷胱甘肽转移酶、羧酸酯酶、细胞色素b基因、三磷酸腺苷合酶基因等,且代谢抗性相关的基因差异表达倍数较高,因此推测小贯小绿叶蝉对噻虫嗪的抗性可能以代谢抗性为主。4.克隆并解析了抗性基因Eo GSTs1的生物信息学特征通过对筛选出来的抗性基因进行克隆测试,成功扩增出一个谷胱甘肽转移酶基因Eo GSTs1（Cluster-166.0）的全长c DNA,其长度为841 bp,预测Eo GSTs1基因编码区的长度为624 bp,共编码207个氨基酸,其中5′端非编码取长度为99 bp,3′端非编码取长度为118 bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,poly A的长度为16 bp;Eo GSTs1基因蛋白分子量值为23.68932 k Da,理论等电点值为6.00;带负电荷的和带正电荷的氨基酸残基数量分别为30个和29个,N端以蛋氨酸起始,半衰期为30 h。在溶液中的不稳定系数为31.87,低于不稳定系数阈值40,脂肪系数值为78.26,总平均疏水性值为-0.376。该蛋白共含有3331个原子,其中碳原子1078个,氢原子1662个,氮原子276个,氧原子305个,硫原子10个。该蛋白包含20种氨基酸,其中含量排名前三的氨基酸分别为丙氨酸Ala（A）、赖氨酸Lys（K）、谷氨酸Glu（E）,数量分别为19个、19个、16个,数量占比分别为9.2%、9.2%、7.7%;含量较低的氨基酸为Cys（C）、His（H）,数量分别为2个和1个,数量占比依次为1%、0.5%。Eo GSTs1基因蛋白中不存在信号肽,且无跨膜螺旋区。此外,该蛋白的催化结构域包含69个氨基酸残基。Clustal Omgea序列比对结果显示,小贯小绿叶蝉与其他四种半翅目的昆虫的GST基因的氨基酸序列具有多个保守氨基酸序列。经Blast同源性分析,结果表明其与枯蝉Subpsaltria yangi、东亚飞蝗Locusta migratoria、葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae、马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata等的GST基因的氨基酸序列相似度较高,分别为53%、52%、52%、50%。多种不同目昆虫的GST基因氨基酸全长序列经ML与BI系统发育分析,两者的拓扑结构基本一致,小贯小绿叶蝉Eo GSTs1基因与已知半翅目昆虫的GST基因聚为一支,与已知蜚蠊目和膜翅目昆虫的GST基因距离较远,与膜翅目、鞘翅目、蜚蠊目的昆虫亲缘关系较远。不同类型GST亚族基因经邻接法进行聚类分析,结果显示,小贯小绿叶蝉Eo GSTs1基因与Sigma亚族的聚为一支,显示出较近的亲缘关系,与Delta和Epsilon亚族距离较远,表明亲缘关系较远。小贯小绿叶蝉Eo GSTs1基因蛋白序列由207个氨基酸组成,包含9个α螺旋和2个β折叠,属于谷胱甘肽转移酶超家族,具有两个保守结构域,与其他昆虫具有较高的相似度;包含2个Asn-Xaa-Ser/Thr序列,其中1个为N-糖基化位点;含有8个潜在的磷酸化位点:丝氨酸磷酸化位点4个,分别位于肽链第95、118、152和166位;苏氨酸磷酸化位点2个,分别位于肽链第47和125位;酪氨酸磷酸化位点2个,分别位于肽链第148和188位。小贯小绿叶蝉Eo GSTs1基因蛋白的三维结构预测结果显示其三维结构与模板德国小蠊的蛋白具有较高的相似度,C-score值为1.21,大于-5小于2,TM-score值为0.88±0.07,大于0.5。5.纯化获得目标蛋白EoGSTs1,初步探明其酶学特征通过原核表达技术,并结合Ni柱亲和纯化获得了目标蛋白EoGSTs1,经SDS-PAGE电泳检测表明EoGSTs1主要以可溶的形式存在,Western blot验证结果显示其与所预测的蛋白分子量23.68932 k Da相一致。酶活测定表明,重组蛋白EoGSTs1（r EoGSTs1）对通用底物CDNB具有催化活性,且在p H 7,温度25℃时酶活力最高。重组蛋白EoGSTs1米氏常数Km为0.07782±0.01990mmol/L,最大反应速度Vmax为12.15±1.673μmol/min·mg。根据其重组酶对模式底物CDNB的催化活性,推测其具有降解外源物质的重要作用。