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鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,AB）是一种需氧、非发酵革兰阴性条件致病菌,广泛存在于自然界,尤其是医院环境及人体皮肤、黏膜、呼吸道、泌尿道中,为条件致病菌,易引起抵抗力低下人群发生感染。构成细菌毒力的物质基础主要是侵袭力和毒素,侵袭力是致病菌能突破宿主皮肤、粘膜生理屏障,进入机体并在体内定植,繁殖和扩散的能力;毒素包括内毒素和外毒素。通常病原菌的毒力越大,其致病性就越强。外膜蛋白A（Outer membrane protein A,OmpA）是鲍曼不动杆菌主要的细胞毒性因子,本研究以临床分离的AB菌株、标准株ATCC17978菌株及OmpA蛋白敲除的鲍曼不动杆菌突变株（omp A-/-AB菌株）为研究对象,对外膜蛋白OmpA的生物信息学特征、构成鲍曼不动杆菌侵袭及毒素、以及在诱导肺上皮细胞自噬及凋亡中的作用进行研究。研究结果如下:1.鲍曼不动杆菌OmpA生物信息学特性本研究选取12株临床分离的AB菌株,提取其DNA,以聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术扩增OmpA基因,结果提示12株临床分离的AB菌株MLST分析分别属于6类ST型,均能检测到OmpA基因。提取总RNA,反转录为c DNA,利用实时荧光聚合酶链反应（Real-time fluorescent polymerase chain reaction,RT-PCR）对AB菌株的OmpA基因的相对表达水平进行分析,12株临床分离的鲍曼不动杆菌OmpA基因的RNA表达水平无显著性差异。提取DNA,聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术扩增OmpA基因,测序结果有24个SNP位点。比对Pubmed上OmpA蛋白的三级空间结构及跨膜结构,OmpA蛋白质有6种三级结构,均由β-桶状结构组成保守结构域,是一种跨膜蛋白。结果说明,OmpA在鲍曼不动杆菌中具有高保守性,临床分离的12株菌株中的OmpA表达水平差异不显著。2.鲍曼不动杆菌OmpA敲除菌株的制备及形态观察利用同源重组的方法获得OmpA基因被Kn抗性基因取代的克隆菌株,命名为ATCC17978/Δomp A::Kn（omp A-/-AB）。将野生型AB菌株及omp A-/-AB菌株分别接种于LB培养基上,提取野生型AB菌株及omp A-/-AB菌株的总RNA,反转录为c DNA,利用RT-PCR检测OmpA基因的相对表达水平,OmpA的相对表达水平野生型AB菌株明显高于omp A-/-AB菌株（P<0.05）。形态学观察可见,野生型AB菌落生长良好,呈圆形,乳白色,潮湿,表面光滑,不透明,略凸在中间。而omp A-/-AB菌落生长中等,形状比野生株小,颜色与野生型菌株相同,边缘整齐,表面湿润,中间微微隆起,野生型AB菌株菌落计数显著高于omp A-/-AB株。结果说明,OmpA基因在鲍曼不动杆菌维持生长活力中起到重要作用,OmpA蛋白是鲍曼不动杆菌重要的组成蛋白。3.OmpA对WTRL1细胞病理学及超微结构的影响野生型AB菌株感染WTRL1细胞,可导致细胞收缩、溶解率增高,细胞活力明显降低,而omp A-/-AB菌株感染WTRL1细胞时,WTRL1细胞收缩程度减轻,细胞溶解率低于野生型,细胞活力显著高于野生型AB菌株感染时（P<0.05）。透射电镜观察,可见正常组WTRL1细胞自噬极少,野生型AB菌株感染WTRL1细胞,可见大量细菌粘附、侵入细胞,细胞内可见较多的双膜空泡的自噬小体形成,并观察到内质网扩张、线粒体脊破裂等典型的自噬表现,同时可见凋亡小体;omp A-/-AB菌株感染WTRL1细胞时,细菌粘附、侵入细胞减少,WTRL1细胞破坏程度降低,自噬小体形成较少（P<0.05）。结果说明,OmpA蛋白对细菌粘附及侵入宿主细胞发挥了重要作用,同时OmpA蛋白可诱导宿主细胞自噬及凋亡的发生,加重细胞的破坏。4.OmpA对SD大鼠肺组织病理学及超微结构的影响野生型AB菌株感染SD大鼠肺组织,HE染色病理学观察可见大鼠肺泡结构明显受损,肺泡腔内可见炎性渗出物,肺泡隔明显增厚、破裂,血管扩张出血,各级支气管周围可见大量炎性细胞,纤毛黏连、倒伏。而omp A-/-AB菌株感染SD大鼠肺组织,HE染色病理学观察可见大鼠肺泡结构受损减轻,肺泡隔轻度增厚、破裂,各级支气管周围可见少许炎性细胞,病理学评分明显低于野生型AB菌株组（P<0.05）。透射电镜观察,可见野生型AB菌株感染SD大鼠肺组织,大量细菌粘附、侵入大鼠肺组织细胞,细胞内可见双膜空泡的自噬小体,内质网扩张,线粒体脊断裂,线粒体空泡形成,同时可见凋亡的发生;而omp A-/-AB组细菌粘附、侵入肺组织细胞少,肺组织细胞破坏程度低,自噬小体形成较少（P<0.05）。结果说明,OmpA蛋白在鲍曼不动杆菌感染宿主细胞时,对细菌粘附、侵入及诱导肺组织细胞自噬及凋亡的发生起到重要作用。5.OmpA对肺组织细胞P62及LC3表达水平的影响通过免疫荧光、免疫组化及Western blotting分析,野生型AB菌株及omp A-/-AB菌株分别感染WTRL1细胞及SD大鼠肺组织时,野生型AB菌株可导致WTRL1细胞及SD大鼠肺组织的P62蛋白的表达水平低于omp A-/-AB菌株感染组（P<0.05）,而LC3蛋白表达水平高于omp A-/-AB菌株组（P<0.05）。说明鲍曼不动杆菌在感染宿主时,OmpA可导致自噬相关蛋白P62表达降低,LC3表达升高,并表现出肺组织细胞自噬的发生。6.OmpA对肺组织细胞m TOR、pm TOR表达水平的影响利用免疫荧光、免疫组化及Western blotting分析,分别使用野生型AB菌株及omp A-/-AB菌株感染WTRL1细胞及SD大鼠肺组织时,野生型AB菌株可引起WTRL1细胞及SD大鼠肺组织中的m TOR及pm TOR蛋白表达水平低于omp A-/-AB菌株感染组（P<0.05）。使用自噬通路中重要分子m TOR抑制剂雷帕霉素（Rapa）干预后,m TOR及pm TOR表达水平进一步降低,P62表达水平下降,LC3表达水平升高,自噬反应增强;使用m TOR促进剂氯喹（CQ）干预后,m TOR及pm TOR表达水平进一步升高,P62表达水平升高,LC3表达水平降低,自噬反应减弱,与omp A-/-AB菌株感染组趋势一致（P<0.05）。结果说明,OmpA通过m TOR通路诱导肺组织细胞自噬。7.OmpA对肺组织细胞p AMPK、AMPK的表达水平的影响采用免疫荧光、免疫组化及Western blotting分析,野生型AB菌株及omp A-/-AB菌株感染WTRL1细胞及SD大鼠肺组织时,WTRL1细胞及SD大鼠肺组织中的p AMPK蛋白及AMPK蛋白表达水平在野生型AB菌株感染组明显高于omp A-/-AB菌株感染组（P<0.05）。说明OmpA诱导肺组织细胞自噬,可能是通过提高m TOR信号通路上游的AMPK和p AMPK基因的表达而发挥作用。8.OmpA对肺组织细胞凋亡的影响野生型AB感染WTRL1细胞,Flow cytometry检测不同时间鲍曼不动杆菌感染对SD WTLRs细胞凋亡的水平。结果提示与正常组比较,第1h、3h WTLRs细胞凋亡逐渐增加,第3h凋亡及死亡率最高。而omp A-/-AB感染3h组、AB+CQ 3h组WTRL1细胞凋亡低于野生型AB感染组。9.OmpA对肺组织细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响野生型AB菌株及omp A-/-AB菌株感染WTRL1细胞及SD大鼠肺组织,通过免疫荧光、免疫组化及Western blotting分析,发现野生型AB菌株感染组的WTRL1细胞及SD大鼠肺组织中Beclin-1、JKN1、Drp-1、caspase-3、caspase-9蛋白表达水平明显高于omp A-/-AB菌株感染组（P<0.05）,Bcl-2表达水平明显低于omp A-/-AB菌株感染组（P<0.05）。结果提示,鲍曼不动杆菌在感染宿主时,OmpA蛋白可导致凋亡及自噬的关键相关蛋白Beclin-1升高,同时引起凋亡相关蛋白JNK1、Drp-1、caspase-3、caspase-9升高,Bcl-2水平下降,说明OmpA可导致肺组织细胞线粒体损伤,诱导凋亡的发生。10.OmpA对SD大鼠血清中炎症因子表达水平的影响野生型AB菌株及omp A-/-AB菌株感染SD大鼠肺组织,通过ELISA检测方法,可见野生型AB菌株感染组SD大鼠的血清中的IL-1β、GM-CSF、INF-γ和TNF-α表达水平较omp A-/-AB菌株感染组明显升高（P<0.05）。结果说明,鲍曼不动杆菌感染SD大鼠肺组织时,OmpA可导致血清中炎症因子水平升高。综上,本研究从OmpA蛋白生物信息学特征、野生型AB菌株及omp A-/-AB菌株感染SD大鼠肺组织时,被感染细胞超微结构与诱导细胞自噬、凋亡分子调控过程等方面进行了分析,结果可见OmpA蛋白在鲍曼不动杆菌感染宿主细胞的过程中,是其毒力的重要因素之一、能加重宿主局部及全身的炎症反应,是诱导细胞自噬及凋亡的重要分子机制,本研究为临床治疗鲍曼不动杆菌感染提供了理论基础。