蓝莓（Vaccinium corymbosum L.）叶斑病是蓝莓生产上的主要病害之一,近年来,随着蓝莓种植面积的增加、品种的增多以及种植方式的多样化,蓝莓叶斑病病害的发生也明显增加,损失日趋严重,防治难度逐步加大,已成为蓝莓生产上的严重障碍。β-氨基丁酸（BABA）是从经过暴晒的番茄根系中分离得到的一种次生代谢非蛋白氨基酸,可以诱导植物抵抗真菌或细菌的侵染,是一种具有广谱诱导抗病活性的植物化学诱导剂。本研究以β-氨基丁酸作为诱导剂,选取兔眼蓝莓中的“灿烂”品种为实验材料,以诱导剂诱导的接种叶斑病菌的蓝莓为实验组,未诱导的接种叶斑病菌的蓝莓为对照组,进行了转录组测序文库的构建。并对不同蓝莓品种总花青素含量进行测定和对叶斑病病叶率进行调查。通过生物学信息分析、基因功能注释和差异分析比较,从文库中筛选出蓝莓抗叶斑病的相关基因,采用荧光定量PCR技术对其中的8个相关基因在抵抗病害过程中的表达情况进行研究,探索这些基因在经过β-氨基丁酸诱导处理后对叶斑病的抗性表达变化。克隆了2个选定的高表达抗病相关基因,对基因的功能进行了初步分析和验证。主要研究结果如下:1、明确了经β-氨基丁酸诱导后蓝莓对叶斑病的诱导抗病性表达。抗病性鉴定结果表明,经β-氨基丁酸叶面喷雾处理蓝莓植株后,蓝莓对叶斑病的抗病性明显提高。植物防御酶活性测定结果显示,β-氨基丁酸诱导处理后,蓝莓叶片中的多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性高于对照。实验结果表明β-氨基丁酸喷雾处理后均可提高蓝莓叶片中PPO、POD、PAL和β-1,3-葡聚糖酶的活性,这些高活性的植物防御酶是β-氨基丁酸诱导蓝莓对叶斑病产生诱导抗病性的生化机制。2、构建了β-氨基丁酸诱导的蓝莓转录组测序文库,全面分析诱导接种后蓝莓叶片的基因表达变化,挖掘与蓝莓叶斑病抗病相关的基因。测序数据通过组装得到了78507个转录本,平均长度为957.92 bp,其中最长转录本长度达15693 bp,最短转录本长度为301bp。在KEGG代谢通路中注释到环境信息处理及信号转导的基因有2122个,注释到有机系统及环境适应的基因有3108个,注释到代谢的基因有7566个,注释到遗传信息处理的基因有2694个,注释到细胞过程的基因有1717个,注释到疾病的基因有3953个。在注释到疾病的转录本中,参与植物病原菌相互作用的转录本有1115个,占注释到代谢基因的14.74%,参与花青素合成的基因有35个。3、通过差异表达文库比较分析,筛选出对蓝莓叶斑病有抗病性的上调高表达基因。差异表达结果显示,上调差异基因数量为900个,下调差异基因数量为531个,总差异基因数量共1431个。在文库中高表达的70个基因中,无特征或假设蛋白的基因有24个,与蓝莓叶斑病病原相关的抗病蛋白基因有11个,编码花青素合成的基因有2个。经Blast2PHI数据库比对结果显示在与蓝莓叶斑病害相关的基因中,转录因子为第一大类,有727个;抗病防御类为第二大类,有200个;细胞循环、效应蛋白及病原致病性相关的基因为第三大类,有45个;控制a-（1,3）-葡聚糖的生物合成等基因相对较少,有7个。通过差异比较分析,从转录组文库的PHI数据库和DEG数据库中随机筛选到对蓝莓叶斑病具有抗病性的11个基因进行Q-PCR检测,研究结果显示,其中8个扩增特异性较好的上调高表达基因在β-氨基丁酸诱导处理的蓝莓叶片中表达,而对照中没有表达。抗病性鉴定结果表明,诱导处理的蓝莓对叶斑病呈抗病表型,未经诱导处理的蓝莓对叶斑病呈感病表型。因此这8个基因是β-氨基丁酸诱导蓝莓对叶斑病具有抗病性的相关基因。4、对诱导表达的两个抗病基因comp126500＿c0＿seq1和comp126556＿c0＿seq2的功能进行初步分析和验证。基因comp126500＿c0＿seq1编码的蛋白含1077个氨基酸,构建蛋白系统进化树结果表明,Comp126500＿c0＿seq1与猕猴桃中的抗病蛋白亲缘关系最近,并预测到comp126500＿c0＿seq1蛋白的保守结构域有2个,蛋白二级和三级结构预测结果表明该蛋白含有38个α-螺旋、32个β-折叠、14个蛋白激酶磷酸化位点和6个糖基化位点,GO富集分析结果表明comp126500＿c0＿seq1蛋白参与DNA修复,调控RNA拼接、胞外分泌等生物过程。对其氨基酸序列进行NCBI序列比对,结果发现comp126500＿c0＿seq1蛋白主要比对为中华猕猴桃、胡杨、栎木、榴莲等物质的抗病蛋白;基因comp126556＿c0＿seq2编码1167个氨基酸,构建的蛋白系统进化树结果表明comp126556＿c0＿seq2蛋白与野桑蚕和山黄麻中的抗病蛋白亲缘关系最近,并预测到comp126556＿c0＿seq2蛋白的保守结构域有3个,蛋白二级和三级结构预测结果表明该蛋白含有45个α-螺旋、16个β-折叠、13个蛋白激酶磷酸化位点和9个糖基化位点,GO富集分析结果表明comp126556＿c0＿seq2参与DNA修复、受体回收、介导运输等生物过程。对其氨基酸序列进行NCBI序列比对,Comp126556＿c0＿seq2蛋白主要比对为柑橘、野桑蚕、马铃薯、辣椒等物质的抗病基因及蓖麻leu-富集蛋白等。对两个基因的质粒构建完成后进行酶切验证,测序结果证明两个基因的片段成功插入载体。原核表达的结果显示基因comp126500＿c0＿seq1和comp126500＿c0＿seq1均成功表达。亚细胞定位结果显示,comp126500＿c0＿seq1和comp126556＿c0＿seq2基因都可能定位在细胞膜和细胞核内。将comp126500＿c0＿seq1基因和comp126556＿c0＿seq2基因转化为p BWA（V）HS-ADR1-L2-Glosgfp（L2）和p BWA（V）HS-ADR1-L1-Glosgfp（L1）转基因拟南芥。抗性检测结果显示转基因拟南芥L1阳性率为100%,L2阳性率为89%。将L1、L2与野生型拟南芥（WT）一起接种蓝莓叶斑病病原菌后进行观察和Q-PCR检测。结果发现接种7 d后WT拟南芥叶片表面开始有病斑,表现出了对该病原菌的应答,而L1和L2接种蓝莓叶斑病病原菌后均未发病。Q-PCR检测结果表明,接种后L1、L2的抗病基因表达量均比接种后的WT拟南芥高,WT表达量几乎为零。以上研究结果表明p BWA（V）HS-ADR1-L2-Glosgfp和p BWA（V）HS-ADR1-L1-Glosgfp增强转基因拟南芥对蓝莓叶斑病病原的抗病性。由此可知,β-氨基丁酸诱导蓝莓体内产生的comp126500＿c0＿seq1和comp126556＿c0＿seq2这两个基因,都是对叶斑病具有抗病作用的相关基因。5、明确了花青素含量是蓝莓抗叶斑病的生理因素之一。转录组数据分析显示,在注释到疾病的转录本中,参与花青素合成的基因有35个,在差异表达文库中高表达上调的70个基因中,编码花青素合成的基因有2个。为了研究不同蓝莓品种的花青素含量与叶斑病发生情况之间的关系,进一步明确蓝莓抗叶斑病的生理因素,分别测定了9个蓝莓品种以及经β-氨基丁酸诱导后的“灿烂”的总花青素含量,并对蓝莓叶斑病病叶率进行调查。实验结果表明南高丛蓝莓品种“奥尼尔”的总花青素含量最高,高达6.5 mg/m L,含量最低的是兔眼蓝莓品种“灿烂”,含量为4.34 mg/m L。经β-氨基丁酸诱导后的“灿烂”品种花青素含量为5.16 mg/m L,比未诱导前高0.82 mg/m L。抗病性调查结果发现,9个蓝莓品种中,“奥尼尔”品种的病叶率最低为4.64%,发病率最高的是“灿烂”品种,达12.98%。根据测定结果、田间调查和相关性分析,发现花青素对蓝莓叶斑病具有一定的抗病性作用,蓝莓花青素含量与蓝莓叶斑病的发病率成反比关系。由此可见经β-氨基丁酸诱导处理,不仅可使蓝莓花青素的含量升高,而且使蓝莓对叶斑病的抗病性提高,因此花青素含量也是蓝莓抗叶斑病的生理因素之一。