茵栀黄注射液抗金黄色葡萄球菌作用及机理研究

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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称SA)是临床上引起化脓性感染和医院内感染以及引起食品污染和细菌性食物中毒的常见的病原菌。兽医临床上常因养殖场饲养密度过大、通风不良、卫生条件差,地面有碎玻璃、铁丝等尖锐杂物刺破动物皮肤而感染金黄色葡萄球菌,如鸭的蹼或趾被划伤而感染。此病易传染,不易治愈,给养殖户造成极大的经济损失。为了解决这一问题,不少学者开展了防治畜禽感染金黄色葡萄球菌的研究工作。目前,国内外治疗SA的药物众多,主要是抗生素治疗。由于SA对抗生素极易产生耐药性,而且近年来其耐药周期越来越短,因此金黄色葡萄球菌病已成为临床治疗棘手的难题。茵栀黄注射液是由茵陈、栀子、金银花中药复方提取物及黄芩甙组成的制剂,具有清热、解毒、利湿、退黄等药理作用,临床上常用于治疗肝胆湿热、恶心呕吐、小便黄赤、急慢性肝炎等病症。国内外研究表明,茵栀黄注射液中的有效成分,如茵陈挥发油、栀子甙、氯原酸、黄芩甙等均有较好的抗SA的作用。本课题在总结国内外有关中药防治金黄色葡萄球菌引起疾病方面的研究资料的基础上,以茵栀黄注射液为研究对象,研究药物抗SA的作用机理,以便为寻找天然抑菌剂提供理论依据。第一,利用杯管法测定不同浓度的受试药物对SA的抑菌圈大小,采用二倍稀释法测定最低抑菌浓度值(MIC),求出MPC/MIC值。结果:茵栀黄注射液对SA的抑菌圈达20.50mm,接近阳性对照组(2.5%庆大霉素对SA的抑菌圈为23.40mm),药液稀释2000倍仍能抑制细菌生长。就MPC/MIC值而言,茵栀黄注射液对SA的MPC/MIC值最低,比值为4,远低于青霉素钾、氟苯尼考注射液等其他抗菌药物。第二,40只鸭随机分组、攻毒,复制鸭金黄色葡萄球菌病理模型,用茵栀黄注射液及氟苯尼考注射液对照治疗,观察药物对鸭金黄色葡萄球菌病的治疗效果。结果:攻毒组的凝血时间与其他三个组相比差异极显著(P<0.01)。茵栀黄组与生理盐水组相比差异不显著(P>0.05)。攻毒组及氟苯尼考组的病死率与生理盐水组相比差异极显著(P<0.01),而茵栀黄组与生理盐水组相比差异不显著(P>0.05)。从相对增重率来看,各组差异不显著(P>0.05),但茵栀黄组15d增重最接近生理盐水组。两个用药组之间及分别与生理盐水组相比脾系数差异均不显著(P>0.05),各组的法氏囊系数差异不显著(P>0.05)。第三,采用玻片法和试管法检测药物对血浆凝固酶活性的影响,甲苯胺蓝核酸琼脂法测定药物对耐热核酸酶(TNase)活性的抑制作用。根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列,设计并合成一对特异性的引物,以茵栀黄注射液作用的细菌基因组DNA为模板,利用PCR技术对其耐热核酸酶nuc基因片段进行扩增,获得了预计大小的片段。琼脂糖凝胶电泳分析,与标准菌株的nuc基因对比分析。结果:茵栀黄注射液在1:1~1:128浓度范围内对SA的结合凝固酶和游离凝固酶活性无影响。茵栀黄注射液1:1~1:8浓度范围内可完全抑制SA的耐热核酸酶活性,即使稀释512倍仍对耐热核酸酶活性有抑制作用,其各浓度抑制率与空白组相比均有极显著差异(P<0.01)。琼脂糖凝胶电泳显示:利用合成的引物成功地扩增出三条长达867bp的特异性条带,其大小与预计的相符。把测序结果与标准mu50菌株序列相对比,二者完全一致。结论:(1)茵栀黄注射液在杀灭SA的同时还具有较强的抑制细菌耐药性产生的能力。(2)茵栀黄注射液体内抗金黄色葡萄球菌的疗效显著。(3)药物没有改变nuc基因的碱基序列,即未对nuc基因造成突变影响。
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