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菠萝(Ananas comosus L.)为凤梨科多年生草本植物,是世界重要的热带果树之一。菠萝SERK1基因(AcSERK1)是菠萝体细胞胚发生的标记基因(Molecular marker gene),在诱导菠萝体细胞获得胚性能力的过程中发挥着重要的功能,该基因已被证明能有效提高菠萝体细胞胚的发生能力。深入研究菠萝体细胞胚发生初期AcSERK1特异性表达调控的分子机制对揭示细胞分化、胚发生和胚早期退化等的分子机理,以及提高体细胞胚的发生频率和同步化水平有着重要意义。本论文在鉴定了AcSERK1 5’上游调控序列的胚性细胞特异启动活性的基础上,进一步分离并鉴定了其5’上游调控序列中具有生物学功能的胚性细胞特异性区段,通过酵母单杂交实验对与该区段互作的候选蛋白进行了筛选。并在表观遗传学水平分析了AcSERK1 5’上游调控序列中CpG岛的甲基化状态以及甲基化作用对AcSERK1表达的影响。这些研究在解析AcSERK1转录调控的分子机制的同时,也为研究菠萝体细胞胚发生的分子调控网络奠定了基础。获得的主要研究结果如下:采用hi-TAIL PCR技术,从‘神湾’菠萝基因组DNA中克隆了AcSERK1起始密码子5’上游序列2503 bp。NCBI在线BLAST结果表明,AcSERK1起始密码子上游2348 nt到2503 nt序列与菠萝PPO1基因有155 bp的序列同源,表明已获得了AcSERK1启动子转录起始位点(TSS)上游序列2090 bp(Genbank:KM264323)。PlantCare预测AcSERK1启动子序列包含TATA-BOX、CAAT-BOX等真核生物启动子核心元件及9个激素响应元件、19个环境响应元件等。为探讨AcSERK1转录调控规律,对其5’上游调控序列的TSS及启动活性进行了分析鉴定。采用5’-RACE技术鉴定出其TSS位于起始密码子(ATG)上游258 nt(G)处。以AcSERK1 5’上游调控序列取代pBI121中的CaMV 35S启动子,构建了植物表达载体pAS2(-2090~+258)::GUS,并瞬时转化菠萝不同组织器官,启动活性分析表明,AcSERK1 5’上游调控序列(-2090~+258)能够启动报告基因GUS在胚性细胞中特异性表达,调控序列启动活性特征与AcSERK1的时空表达特性相同,该序列具有完整的启动子功能,并表现出显著的胚性细胞特异启动活性。为分离鉴定AcSERK1启动子的胚性细胞特异性区段,构建了一系列启动子的5’-端续减缺失植物表达载体和内部缺失植物表达载体。经瞬时转化菠萝胚性愈伤组织后进行启动活性分析,发现AcSERK1 5’上游调控序列中的-983 nt~-880 nt段序列为启动子的胚性细胞特异性区段,是AcSERK1启动子胚性细胞特异性启动活性的必要区段。AcSERK1 5’上游调控序列中的胚性细胞特异性区段-983 nt~-880 nt序列被插入pAbAi载体后,构建起了酵母单杂交诱饵载体。将该诱饵载体转入酵母Y1H Gold菌株感受态细胞中,在添加不同浓度金担子素A(AbA)的SD/-Ura缺失培养基上检测诱饵酵母菌株自转录激活情况,发现AcSERK1 5’上游调控序列中的胚性细胞特异性区段-983 nt~-880 nt在AbA浓度为600 ng/mL时自转录激活得到有效抑制。在此基础上从菠萝体细胞胚酵母单杂交cDNA文库中筛选与胚性细胞特异性区段互作的蛋白,筛选得到与该区段可能互作的蛋白编码基因包括核糖体蛋白、DNA结合蛋白和未知功能蛋白的编码基因,为进一步深入研究AcSERK1表达调控机制提供候选蛋白。EMBOSS Cpg plot预测AcSERK1 TSS附近包含2个CpG岛。采用BSP技术对CpG岛在胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织中的甲基化状态进行了分析。其中,CpG-1岛包含32个CpG位点,在胚性细胞中29个胞嘧啶(C)位点未发生DNA甲基化,3个位点发生甲基化;而在非胚性细胞中有29个位点发生甲基化,3个位点未发生甲基化。CpG-2岛共包含16个CpG位点,在胚性细胞中有2个位点未发生DNA甲基化,在非胚性细胞中有11个位点发生DNA甲基化。AcSERK1 TSS附近的2个CpG岛在胚性细胞中发生甲基化的位点个数比非胚性细胞中发生甲基化的位点个数明显减少。将菠萝愈伤组织在含5μM/L甲基化抑制剂5-azaC的液体MS培养基中悬浮5 d能够提高AcSERK1在非胚性愈伤组织中的表达量,而且甲基化抑制剂5-azaC能够加速菠萝体细胞诱导成胚的进程。