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目前已发现许多真核生物编码circRNAs,越来越多的研究显示circRNAs具有miRNAs海绵体、与蛋白质相互作用、调节基因转录、翻译蛋白等功能,circRNAs在许多疾病的发生、发展过程中扮演重要的角色,并有可能成为新的药物治疗靶点。最近的一些研究发现,人类疱疹病毒EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、卡波西肉瘤疱疹病毒(Kaposi’s Sarcoma Herpesvirus,KSHV)和人乳头瘤病毒16型(Human Papillomavirus 16,HPV16)等一些具内含子的病毒基因的转录本可以形成circRNAs。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是引发原发性肝癌的重要原因之一,已有一篇研究报道了1条起源于HBV前体基因组pgRNA的circRNA,并发现该circRNA并不是通过常规的反向剪接形成的,宿主的RNA解旋酶DHX9(DEx H-Box Helicase 9)参与了HBV circRNA的形成,但HBV形成circRNA的机制仍未明确,有关HBV起源的circRNA的功能研究仍没有涉及。本课题组前期的研究中发现了一个新的HBV编码的circRNA(命名为HBV＿circ＿1),初步体外研究结果证实HBV＿circ＿1能抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖、提升HBV复制水平,并发现HBV＿circ＿1可能通过miRNA-6124/ST7轴和与细胞周期蛋白依赖性激酶-1((Cyclin Dependent Kinases 1,CDK1))互作促进肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)的发生和发展。本研究在此基础上,深入探讨了HBV编码的circRNA HBV＿circ＿1的形成机制,研究了HBV＿circ＿1对肿瘤发生与发展过程的影响、抑制细胞自噬及其作用机制,探讨了HBV＿circ＿1编码X蛋白的可能性。有关研究结果不仅能进一步加深对HBV基因组编码信息的理解,为circRNA的形成提供新的机制,也可从新的角度阐释HBV引起原发性肝癌的机制,为从RNA水平上治疗HBV感染引起的肝癌提供新靶点。1、HBV＿circ＿1来源及形成机制HBV编码的新circRNA HBV＿circ＿1长度约为2.5kb,其序列与HBV基因组(Gen Bank accession No.KU668446.1)489-2985 nt区域的序列对应,前期的研究通过PCR、Sanger测序以及Northern blotting对HBV＿circ＿1进行了初步验证。本研究在确认HBV＿circ＿1是环状RNA分子的基础上,通过序列比对和HBV＿circ＿1序列测定确认HBV＿circ＿1来源于HBV的pgRNA。HBV＿circ＿1上含有两个Junction sites(分别命名为Junction site A和Junction site B)。研究结果证实Junction site A是由位于pgRNA末端的正向重复序列通过同源重组形成,Junction site B是由切除pgRNA上对应于HBV基因组(Gen Bank accession No.KU668446.1)489-3182-2985nt区域的序列后连接形成,位于pgRNA末端的正向重复序列可促进circRNA形成,推测该过程有蛋白参与。2、HBV＿circ＿1对肿瘤发生与发展的影响前期的研究结果显示HBV＿circ＿1能抑制肝癌细胞HepG2细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖、提升HBV复制水平,暗示HBV＿circ＿1可能在肿瘤的形成和发展中发挥重要作用。本研究进一步探讨了HBV＿circ＿1对不同细胞表型特征的影响。流式细胞术检测结果显示,与转染表达circ GFP的对照质粒pLCDH-circ＿GFP相比,转染表达HBV＿circ＿1的质粒pLCDH-HBV＿circ＿1能促进正常小鼠肝细胞AML-12、人脐静脉内皮细胞HUVEC和肝癌细胞HepG2、SMMC-7721的增殖,加快AML-12、HUVEC和SMMC-7721的细胞周期进程;将转染pLCDH-HBV＿circ＿1或转染pLCDH-ciR空载的SMMC-7721细胞移植至裸鼠,结果显示,HBV＿circ＿1能促进SMMC-7721细胞在体内形成肿瘤。PCR结果显示,在转染pLCDH-HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体组织中存在HBV＿circ＿1,除在一例成瘤小鼠的肝脏组织中检测到HBV＿circ＿1外,在其他组织(心脏、肾脏、小肠、胃、肌肉以及脑)中均未检测到HBV＿circ＿1。对瘤体进行HE染色和免疫组化的结果显示,转染pLCDH-HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体的恶性程度以及瘤体中Ki67和Cyclin D1的表达水平均高于对照组。这些结果表明,HBV＿circ＿1能加快细胞周期进程,促进细胞增殖,促进肿瘤的形成与发展。3、HBV＿circ＿1抑制细胞自噬及机制研究自噬在肿瘤的发生与发展中扮演重要角色,本研究中从自噬角度探讨了HBV＿circ＿1促进肿瘤发生、发展的机制。Western blotting和细胞免疫荧光的结果显示,瞬时表达HBV＿circ＿1能促进p62的累积和聚集、抑制LC3-II形成、抵消雷帕霉素对自噬的促进作用,而敲降HBV＿circ＿1的表达促进HepG2.2.15细胞自噬的发生,说明HBV＿circ＿1可以抑制细胞自噬。免疫组化的结果显示,在注射表达HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体中p62的累积量明显高于对照组,证实了HBV＿circ＿1能够抑制自噬。qPCR结果显示,调节HBV＿circ＿1表达对自噬起始复合物关键基因的表达无明显影响,暗示HBV＿circ＿1不参与调节自噬起始过程。RNA pull down、RIP实验结果证实HBV＿circ＿1与PHB2互作。信息学分析结果显示,PHB2与HBV＿circ＿1的结合区域包含了PHB2与LC3的结合区域,暗示HBV＿circ＿1可能与LC3竞争性结合PHB2。CO-IP实验证实,HBV＿circ＿1可抑制PHB2与LC3之间的相互作用,而HBV＿circ＿1的突变体(缺失与PHB2结合区域)则不能与LC3竞争性结合PHB2,也失去了抑制细胞自噬的作用。这些结果表明HBV＿circ＿1通过与LC3竞争性结合PHB2发挥抑制自噬的作用,并由此促进肿瘤的发生与发展,研究结果为理解HBV的致癌机理提供了新的视角,也为HBV诱导的肝癌治疗提供了新的靶点。4、HBV＿circ＿1能够编码X蛋白已有研究证实部分circRNAs能以帽子结构非依赖性方式编码蛋白。对HBV＿circ＿1序列进行了信息学分析,发现HBV＿circ＿1上有HBx的完整开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)、内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)和N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine,m~6A)修饰位点,推测HBV＿circ＿1具有编码X蛋白的潜力。细胞免疫荧光检测结果显示,在转染HBV＿circ＿1表达质粒pLCDH-HBV＿circ＿1的HepG2细胞中存在少量X蛋白;用Ds Red序列替换pLCDH-HBV＿circ＿1质粒中HBx的ORF,构建pLCDH-HBV＿circ＿1-Ds Red重组质粒,在转染pLCDH-HBV＿circ＿1-Ds Red的HepG2细胞中也能观察到Ds Red的表达。进一步,通过免疫组化在转染pLCDH-HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体中检测到X蛋白,而在转染pLCDH-ciR的SMMC-7721细胞形成的对照瘤体中检测不到X蛋白。以上结果说明HBV＿circ＿1能够编码X蛋白。研究结果从HBV＿circ＿1编码X蛋白的角度解释了HBV＿circ＿1促进癌症的发生、发展过程的机制。