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马铃薯晚疫病（Potato Late Blight）由致病疫霉菌（Phytohthora infestans）侵染马铃薯引起,该病害在适宜的温湿度条件下能快速造成病害流行,造成马铃薯减产甚至绝产,是一种毁灭性植物卵菌病害。农业生产上控制马铃薯晚疫病最有效的手段是栽种马铃薯抗病品种,但是随着致病疫霉菌不断变异,马铃薯抗性资源日益匮乏,现有的马铃薯晚疫病病害防控也受到了严峻的挑战。在致病疫霉侵染寄主植物过程中可触发植物体产生两类免疫反应:Pathogen Associated Molecular Patterns（PAMPs）触发的（PAMP triggered immunity,PTI）防卫反应和无毒效应分子触发的（effector triggered immunity,ETI）免疫反应。同时,致病疫霉可通过分泌效应分子抑制寄主免疫反应导致植物感病,从而成功侵染寄主,然而有许多致病疫霉效应分子诱导寄主感病性的具体生化机理尚不清楚。研究效应分子调控植物感病机制,不但能解析致病疫霉的致病机理,为设计防治马铃薯晚疫病提供新策略,也对破解其它植物疫病的致病成灾机制具有一定的参考价值。本实验室先前研究首次报道了大豆疫霉菌分泌一个具有Nudix水解活性的效应分子PsAvr3b来操控植物的免疫反应,且PsAvr3b需要招募大豆的Cyclophilin蛋白激活其酶活功能,但是,全基因组测序其它疫霉菌发现橡树疫霉、致病疫酶、辣椒疫霉和烟草疫霉分别含有3个、5个、1个和5个RXLR-Nudix效应分子,并且这些效应子具有很高的序列变异度,提示其可能具有复杂的生物学功能。本论文以致病疫霉菌Nudix效应分子为主要研究对象,综合利用生物信息学、分子生物学、细胞生物学、生物化学等技术手段,系统研究了致病疫霉菌的Nudix效应子的生物学功能。生物信息学研究初步发现致病疫霉菌基因组中存在5个Nudix效应分子同源序列,但是2个基因序列因为序列突变或者不转录而被认为是假基因。我们提取致病疫霉菌T30-4侵染番茄不同阶段的RNA,构建cDNA混合样品库,从中克隆到三个Nudix效应分子基因:NUD1（PITG15679）、NUD2（PITG05846）和 NUD3（PITG06308）,这三个基因都具有两个内含子,其中NUD3通过可变剪切可产生两种转录本NUD3.1和NUD3.2。NUD1.NUD2和NUD3.2都具有完整的Nudix水解酶保守功能域,而NUD3.1因为可变剪接差异导致终止密码子提前出现,从而丢失了 Nudix水解酶功能域。qRT-PCR结果显示这些基因在致病疫霉侵染番茄的早期显著上调表达,其中NUD3.2在侵染6h时表达量最高,NUD2其次,而NUD1在侵染各个阶段的表达量都很低,提示NUD2和NUD3.2在致病疫霉侵染寄主过程中可能具有重要作用。在本氏烟草中过表达三个致病疫霉Nudix效应分子时发现,只有NUD3.2可以帮助疫霉菌侵染,按时NUD3.2可能在致病疫霉侵染寄主过程中发挥了重要的作用,同时说明致病疫霉3个Nudix效应分子可能在功能上存在一定的分化。明确Nudix水解酶的底物是进一步解析效应子生物学功能的重要基础,我们通过构建序列进化树,发现这些效应分子的Nudix水解酶功能域与已知的以AP6A为底物的水解酶聚类在一起,推测其底物可能更偏好AP6A及其类似物。由于致病疫霉菌的三个Nudix蛋白均不含有和Cyclophilin互作的保守氨基酸位点,因此推测其活性可能不需要被植物激活,因此可通过原核表达产生大量有活性的重组蛋白。我们利用UPLC-ESI-MS/MS并结合体外生化实验,证实Nudix效应蛋白具有水解Ap6A的活性,为进一步验证其水解酶活性,我们在效应分子Nudix功能域中突变了与酶活相关的四个关键氨基酸催化位点,并构建了 NUD2QQQQ和NUD3.2QQQQ2个突变体,生化证据显示突变体显著丧失了水解AP6A的能力。为研究Nudix效应分子在晚疫病与寄主互作中的作用,显微观察发现三个致病疫霉Nudix效应蛋白定位在细胞膜和细胞质,并检测其在烟草上是否能抑制疫霉菌激发子诱导细胞坏死。初步研究发现三个Nudix效应分子在本氏烟草上均具有抑制致病疫霉菌胞外激发子INF1诱导细胞坏死的能力,但是只有NUD3.2可以抑制新型激发子PiXEG1诱导的细胞坏死。而效应分子酶活突变体NUD2QQQQ和NUD3.2QQQQ在细胞中的定位并未发生改变,但是丧失了抑制INF1诱导的细胞坏死的能力,NUD3.2QQQQ也丧失了抑制PiXEGl引发的细胞坏死的能力,推测Nudix效应分子抑制激发子诱导的细胞坏死的功能并不依赖其水解酶活性。为进一步检测Nudix的活性是否与其亚细胞定位相关,我们在Nudix效应蛋白的C端添加了核定位信号,构建了突变体NUD2-NLS和NUD3.2-NLS,发现其定位显著聚集在本氏烟细胞核内,抑制疫霉菌激发子诱导细胞坏死功能研究表明,NUD2-NLS和NUD3.2-NLS丧失了抑制INFl,PiXEGl诱导细胞坏死的能力,NUD3.2-NLS也不能抑制PiXEG1引发的细胞坏死,说明致病疫霉Nudix效应分子的细胞质定位对其毒性功能的发挥起到了重要的作用。本论文研究结果首次揭示了致病疫霉菌Nudix效应分子的基因结构和其在侵染早期的基因表达模式,报道了 Nudix效应分子的亚细胞定位以及这类效应分子的一种新型底物Ap6A,明确了 Nudix效应分子可通过抑制两种疫霉菌激发子的活性进而促进疫霉菌的侵染,且这些功能主要依赖于其酶活性和细胞质定位。病疫霉菌Nudix效应分子主要依赖其水解酶活性,抑制植物免疫反应并促进病原菌侵染的致病机理是相对保守的,并且它们彼此间的功能在进化过程中也发生明显的分化。