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CD4+T辅助细胞(Th细胞)是继发性免疫系统的重要成份,其类型影响了免疫反应的结果。在正常条件下,Th细胞亚型的分化及调节是受严格有序地调控以维持免疫稳定,但在病理情况下,这种稳定被破坏,Treg/Th17和Treg/Th1比值明显下降,这种Th细胞亚型的变化与疾病的物质代谢紊乱呈显著的相关性。AGEs是糖与蛋白和/或脂质经过非氧化和氧化反应生成的一类异质分子,参与机体多种免疫相关性疾病的发生发展。然而,AGEs对CD4+T细胞分化的作用尚未见报道。本文试图通过体外实验,观察AGEs对CD4+T细胞表型转换及对Treg细胞抑制功能的影响,并探讨其作用机制,旨在从干预Th细胞分化的角度为临床治疗相关疾病提供新思路。本研究分三个部分。第一部分AGEs对初始CD4+T细胞表型分化的影响目的：探讨AGEs对初始CD4+T细胞表型分化的影响。方法：以CTCM、BSA、葡萄糖为对照,用AGEs处理初始CD4+T细胞72h,采用流式细胞术进行表面及胞内细胞因子染色检测细胞表型。并从经过AGEs处理的细胞中提取mRNA,采用RT-PCR方法检测Th特异性转录因子基因表达水平。用AGEs处理Treg细胞后与初始CD4+T细胞共培养,采用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法检测经AGEs处理的Treg细胞对初始CD4+T细胞增殖抑制的影响。结果：与对照组、BSA组、葡萄糖组相比,用AGEs处理初始CD4+T细胞后,CD4+细胞群内IFNy和IL-17A细胞因子水平较均明显增高(p<0.05)。而IL-4和FoxP3细胞因子水平在各组之间无明显差异(p>0.05)。Th1细胞特异性转录因子Tbet和Th17细胞特异性转录因子RORyt表达水平亦明显增高(p<0.05)。而Th2细胞及Treg细胞特异性转录因子GATA3和FoxP3表达水平在各组间无明显差异(p>0.05)。在无AGEs预处理的Treg细胞共培养情况下,初始CD4+T细胞增殖下降了86.89%。而用AGEs预处理Treg细胞后,Terg细胞的抑制能力呈剂量依赖性受到限制。结论：AGEs诱导了初始CD4+T细胞向Th1和Th17细胞转换,并且干预了Treg细胞的抑制功能,促进了初始CD4+T细胞向促炎症方向发展。第二部分RAGE在AGEs诱导的初始CD4+T细胞向促炎症反应方向发展中的作用目的：探讨RAGE在AGEs诱导的初始CD4+T细胞向促炎症方向发展中的作用。方法：新鲜分离的初始CD4+T细胞用AGEs、BSA及高糖处理后,分别提取细胞裂解液和总RNA。采用Western blotting和RT-PCR方法分别检测RAGE的蛋白和基因表达水平。并用shRNA沉默初始CD4+T细胞中的RAGE基因,用流式细胞术检测其IFNγ和IL-17a细胞因子水平。用RAGE shRNA或Luc shRNA转导Treg细胞后与初始CD4+T细胞共培养,采用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法检测初始CD4+T细胞增殖情况。结果：与对照组相比,AGEs明显增加了初始CD4+T细胞中RAGE的蛋白和mRNA水平。与未转染shRNA或转导非特异性Luc shRNA的细胞比较,转染了RAGE shRNA的初始CD4+T细胞IFNγ (p=0.003)或IL-17a (p=0.004)阳性百分率明显下降。未用shRNA处理的Treg细胞明显抑制了初始CD4+T细胞增生,AGEs可以逆转这种抑制作用。然而,经RAGE shRNA转染的Treg细胞,其对初始CD4+T细胞增殖能力的抑制作用不再受AGEs的影响。结论：在AGEs诱导的初始CD4+T细胞分化成Thl和Th17细胞表型的过程中,RAGE介导了细胞的转化。而且,AGEs干预Treg的抑制细胞增殖能力也是通过AGE-RAGE轴实现的。第三部分PPARγ活性在AGEs诱导的初始CD4+T细胞向促炎症反应方向发展中的作用目的：探讨PPARγ在AGEs诱导的初始CD4+T细胞向促炎症反应方向分化中的作用。方法：用RAGE shRNA转染初始CD4+T细胞,用Western blotting检测其PPARγ表达水平。用PPARγ激活剂(或配体)PGJ2处理初始CD4+T细胞后再用AGEs培养,检测其IFNy和IL-17a细胞因子水平。用PPARγ拮抗剂PD68235处理RAGE shRNA转染的初始CD4+T细胞,检测其IFNy和IL-17a细胞因子水平。用PGJ2或PD68235分别处理经或无RAGE shRNA转染的Treg细胞,再与初始CD4+T细胞共培养,采用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法检测初始CD4+T细胞增殖情况。结果：仅用AGEs处理的初始CD4+T细胞PPARγ表达水平明显下降,而用RAGE shRNA转染的初始CD4+T细胞,AGEs对其PPARγ表达水平无明显影响。AGEs增加了CD4细胞的IFNγ或IL-17a阳性细胞百分率,但PGJ2明显地抑制AGEs的作用；与未用PD68235处理者相比,PD68235处理RAGE shRNA转染的初始CD4+T细胞,IFNγ或IL-17a阳性细胞的百分率明显回升(p=0.003)。PGJ2可以逆转AGEs对Treg细胞功能的干预,而PG68235则抵消了Treg细胞的抑制功能。结论：PPARγ活性的抑制在AGEs诱导初始CD4+T细胞分化及干预Treg抑制功能中起重要作用。