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德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌是酸奶生产的必备发酵剂菌种,二者共生使牛乳快速酸化制成酸奶。两菌共生机制复杂多样,备受关注,但尚未完全明确,尤其是共生的信号转导方面的研究鲜有报道。双组分信号转导系统是细菌感受外界环境刺激作出相应反应的重要调控机制。本研究从中国牧区传统发酵乳中分离获得的酸奶发酵剂优良菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种CH3菌株和嗜热链球菌CS5菌株为试验材料,探讨TCS与两菌共生的关系,旨在从TCS的角度来揭示两菌的共生机制,进而为完善两菌的共生机制奠定基础。首先根据现已公布嗜热链球菌LMG18311菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种BAA-365菌株中TCSs的核苷酸序列信息设计相应的引物,分别以CS5和CH3菌株的基因组DNA为模板,扩增菌株中的TCSs基因,测序比对。结果表明,CH3中含有7个TCSs,命名为HPK1/RR1-HPK7/RR7;CS5中含有8个TCSs,命名为HPK1/RR1-HPK2/RR2,HPK4/RR4-HPK9/RR9。通过测定CH3、CS5菌株单菌培养及两菌共生时,菌株的生长和产酸情况,绘制菌株的生长曲线和pH值曲线,明确菌株的发酵时期(迟缓末期、对数初期、稳定期、衰退初期、衰退末期)。采用实时定量PCR技术,研究CH3、CS5单菌和两菌共生培养,在上述发酵过程中,CH3和CS5菌株中各自TCSs的表达量的变化。研究表明,两菌混合发酵导致了菌株中部分TCSs表达量发生明显变化,差异表达明显的TCSs主要包括CS5中hpk2/rr2、hpk4/rr4、hpk7/rr7;CH3中hpk1/rr1、hpk2/rr2、hpk3/rr3、hpk7/rr7。采用基因失活和功能鉴定,确定共生中发生明显变化的关键TCSs,在两菌共生关系中的作用。首先研究CH3菌株中关键TCS基因hpk1/rr1在共生关系中的作用。以实验室前期构建的CH3菌株中关键TCS基因hpk1/rr1失活的突变菌株CH3-H、CH3-R菌株为实验材料,研究突变株CH3-H、CH3-R和野生型CH3分别与CS5菌株共生发酵酸奶,比较生长能力、产乙醛能力和产黏性能。研究表明,突变株CH3-H、CH3-R的这三个指标均低于野生型菌株CH3,说明hpk1/rr1对菌株CH3的生长能力、产乙醛能力、产黏能力具有显著下调作用。根据嗜热链球菌CS5的关键TCS基因进行相应引物的设计,通过PCR扩增差异表达明显的hpk2-u、rr5-u片段,将片段连接到乳酸菌自杀性载体pRV300中,成功的获得两个自杀性重组质粒。并已建立制备嗜热链球菌CS5感受态方法,明确其红霉素敏感性,确定筛选浓度为后续的实验进行筛选获得关键基因失活的CS5突变体菌株奠定基础。