木糖醇具有抑制龋齿、利于糖尿病人辅助治疗、护肝等多种生理功能,在食品、医药、化学工业得到广泛应用。天然利用木糖生产木糖醇的菌株很多,但产率不高,一般通过基因工程手段改造菌株,构建高表达木糖还原酶的重组菌株,提高木糖醇产率。本文利用基因工程技术,以实验室筛选的高产木糖醇菌株季也蒙毕赤酵母基因组为模板,克隆得到该菌木糖还原酶基因,利用电转化法将木糖还原酶基因转入到毕赤酵母GS115中,构建表达木糖还原酶的重组菌株。该菌过量分泌表达了木糖还原酶,为后续发酵法高产木糖醇基因工程菌株奠定基础。结果如下：1.以实验室筛选的季也蒙毕赤酵母基因组为模板,PCR克隆得到木糖还原酶基因,用1%琼脂糖凝胶电泳检测,得到一条1000bp左右目的条带,测序结果显示PCR扩增产物长度是1127bp,其中目的基因长度954bp,通过Blast与GenBank中公布的两种季也蒙毕赤酵母的木糖还原酶基因序列对比分析,同源性分别达到92%和96%。2.综合分析表达载体酶切位点图谱与木糖还原酶基因测序结果,在引物上下游加入合适的酶切位点EcoRI和Xbal,重新合成引物,将PCR扩增产物与T载体连接,转入到大肠杆菌,获得抗AMP的转化子,体内T质粒含有木糖还原酶基因,长度大约为4300bp。3.将酶切后具有相同粘性末端的木糖还原酶基因与和pPICZαA连接,先转入到大肠杆菌DH5α中,构建含有木糖还原酶基因的酵母表达质粒pPICZaA-XYL,将其用Sad酶线性化,电转入毕赤酵母GS115中,使季也蒙毕赤酵母的木糖还原酶基因成为表达宿主毕赤酵母GS115基因组的一部分,获得具有zeocin抗性的重组转化子。4.用甲醇诱导含有木糖还原酶基因的重组菌株毕赤酵母GS115-XYL,分别以含有木糖还原酶基因的原菌季也蒙毕赤酵母作为对照1,含有空质粒pPICZaA的毕赤酵母GS115作为对照组2,结果表明：对照组1细胞内破碎液样品含有分子量大小与目的蛋白一致的蛋白,但是浓度远不及重组菌株毕赤酵母GS115-XYL,对照组2上清液中不含有任何条带,重组菌株毕赤酵母GS115-XYL在诱导表达96h时,上清液分泌的表达蛋白量高,SDS结果显示得到一条目的蛋白条带,分子量为36KDa左右,由于上清液几乎不含有宿主菌毕赤酵母GS115自身分泌的杂蛋白,因此可以初步确定重组菌株毕赤酵母GS115-XYL在用甲醇诱导96h时,木糖还原酶得到高效表达。