烧伤是临床常见创伤,特别是大面积重症烧伤以其高死亡率一直是临床关注焦点之一。而烧伤引起的一个显著临床特征就是血管通透性增高造成的局部皮肤水肿、水泡形成。在大面积烧伤病人中,水肿不仅仅是发生在局部,也表现在远隔组织器官,有人在大于25%体表面积的烧伤病人中观察到全身性的水肿形成。烧伤局部产生的大量炎性因子及氧自由基等释放入血进而引起远隔脏器,如肌肉、肠道、脑、肺等的血管通透性增高、组织水肿。水肿、渗出以及皮肤缺损导致的非显性失水导致血容量快速下降,如果没有及时补液则极容易导致低容量性休克。另外发生在四肢的较深范围较大的烧伤可以阻碍静脉以及淋巴的回流进而加重低容量性休克。因此在临床上,烧伤的治疗主要是根据烧伤面积以及深度进行大量补液以维持循环稳定,而在血管高通透的同时,大量补液会加重组织水肿。另外水肿可以造成都组织缺血及感染。导致血管通透性增加的途径有很多,如热力的直接损伤导致内皮受损,凝血酶、内皮生长因子等通过各种信号转导,影响内皮骨架蛋白以及内皮间链接导致血管通透性增加。另外许多炎性因子如TNF-α等也参与了血管通透性增加。最近有研究证明,内皮细胞凋亡信号在血管通透性增加的过程中发挥了重要作用。细胞内在凋亡信号即线粒体依赖途径通过释放cytochrome c及smac等小分子凋亡促进蛋白进入细胞质,进而激活caspase-3。激活的caspase-3可以裂解众多底物,其中包括内皮间链接蛋白β-catenin。β-catenin链接了细胞骨架蛋白Actin与VE-cadherin,裂解β-catenin导致Actin与VE-cadherin链接断裂从而使得内皮间链接打开,血管通透性增加。大面积的烧伤可以造成远隔器官的损伤,而在众多远隔脏器中,肺是最容易受损的器官之一。目前大量研究表明,各种因素导致的肺内或全身炎症反应(SIRS)是急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合症(ARDS)的主要发病因素。多型核细胞(PMN)、巨噬细胞的活化以及释放的大量炎性介质是ALI的特征。炎性因子中TNF-α是介导ALI的主要因子,其介导内皮细胞受损,血管通透性增加,白细胞迁移及粒细胞脱颗粒等。IL-1β则可刺激多种趋化因子如IL-8等的产生,在ALI/ARDS炎症级联反应中其重要作用。近年来,凋亡在ALI中的作用逐渐被重视。肺内皮细胞以及上皮细胞的凋亡使得肺血管内皮-肺泡上皮屏障受损,血管内皮间隙增大、通透性增加,加重液体及蛋白渗出造成组织间隙、肺泡水肿,引起气体交换功能障碍,而组织水肿则可压迫血管导致通气/血流比例失衡进一步加重ALI/ARDS。虎杖多年来一直是中医治疗烧伤、创伤创面愈合治疗方剂中的一味主药。虎杖苷(polydatin,PD)是虎杖的有效活性成分,其化学名为3,4’,5-三羟基芪-3-13-D-单葡萄糖苷(3,4,5-trihydroxystilbene-3-B-mono-D-glucoside)。经过 30年的研究,大量实验表明PD可以改善休克微循环,促进烧伤创面愈合,抑制白细胞粘附,具有显著的抗炎抗氧化作用。近年来本实验室证明PD可以通过抑制氧化应激,稳定溶酶体,抑制线粒体通透性转变孔(mPTP)开放而保护线粒体。基于炎性介质、凋亡在血管通透性增加和ALI/ARDS发病机制中的重要作用,我们假设PD可以通过抑制细胞内在凋亡信号及炎症释放从而发挥在烧伤后血管通透性增加以及ALI中的保护作用。方法第一部分 虎杖苷对烧伤后血管通透性增高的影响药物剂量实验分为十一组(每组10只):假烧伤(sham burn)组,烧伤+生理盐水(burn+NS)组,烧伤+低浓度环孢霉素A(burn+CsA-L)组,烧伤+中浓度环孢霉素A(burn+CsA-M)组,烧伤+高浓度环孢霉素A(burn+CsA-H)组,烧伤+低浓度白藜芦醇(burn+Res-L)组,烧伤+中浓度白藜芦醇(burn+Res-M)组,烧伤+高浓度白藜芦醇(burn+Res-H)组,烧伤+低浓度虎杖苷(burn+PD-L)组,烧伤+中浓度虎杖苷(burn+PD-M)组,烧伤+高浓度虎杖苷(burn+PD-H)组。三种CsA剂量分别为:3mg/kg,6mg/kg,9mg/kg;三种Res剂量分别为:15mg/kg,22.5mg/kg,30mg/kg;三种 PD 剂量分别为:30mg/kg,45mg/kg,60mg/kg。大鼠麻醉后,背部脱毛约30%体表面积,以100℃(假烧伤组为37℃)水烫背部30s致Ⅲ度烧伤。予以生理盐水或相应药物治疗,观察动物存活时间,以确定最适药物剂量。在体水平的的实验分为五组:假烧伤(sham bum)组,烧伤+生理盐水(burn+NS)组,烧伤+环孢霉素A(bum+CsA)组,烧伤+白黎芦醇(burn+Res)组,烧伤+虎杖苷(burn+PD)组。100℃(假烧伤组为37℃)水烫背部体表面积约30%致Ⅲ度烧伤,予以相应生理盐水或药物(环保霉素6mg/kg,白藜芦醇22.5mg/kg,虎杖苷45mg/kg)静脉注射后微量泵持续补液并记录平均动脉压(MVP)变化情况。5小时后,剖腹并在正置荧光显微镜、实验室分析软件NIS-Element BR观察分析1小时内小肠系膜微静脉荧光白蛋白渗出情况,并计算荧光值变化即ΔI=l-(Ij-Io)Ii,其中Ii代表血管内平均荧光强度,I。代表血管外平均荧光强度,ΔI越大通透性越高。探讨内在凋亡信号在血管通透性增加的机制中,过氧化氢脂质(LPO)分析试剂盒检测血清及系膜血管组织中的过氧化脂质含量;蛋白免疫印迹法检测系膜血管组织中cytochrome c及smac蛋白含量;荧光分析试剂盒检测系膜血管组织中caspase-3活性;免疫荧光法观察微静脉中β-catenin形态学变化。离体水平实验分为三组:假烧伤(sham bum)组,生理盐水+烧伤(NS+burn)组,虎杖苷+烧伤(PD+burn)组。大鼠麻醉后予以相应生理盐水或虎杖苷(45mg/kg)预处理并腹部剪毛,30min后80℃水烫伤腹部30s后急性分离一根60-100μm微静脉。利用特制的玻璃套管对游离的单根皮肤微静脉两端插管,模拟体内循环状态,进行荧光白蛋白及药物的灌注。用图像分析软件Imaging Workbench2计算一定时间内血管内外荧光强度,其比值的变化速率由通透系数Pa表示(Pa=(l/ΔIf)(dIf/dt)0(r/2),其中ΔIf表示荧光白蛋白在测量窗口的荧光强度的快速变化的差值,(dIf/dt)0代表荧光白蛋白渗出管壁的速度,r为微静脉的半径,Pa值越大表示通透性越高。第二部分 虎杖苷对烧伤后肺损伤的保护作用实验分为假烧伤(sham burn)组,烧伤+生理盐水(burn+NS)组,烧伤+虎杖苷(burn+PD)组。100℃(假烧伤组为37℃)水烫背部体表面积约30%致度烧伤,予以相应生理盐水或虎杖苷(45mg/kg体重)治疗,并根据parkland公式予以腹腔注射补液。24小时后,分别以苏木精—伊红染色(hematoxylin-eosinstaining,HE)法观察肺部病理变化,伊文思蓝(Evans blue,EB)法检测肺微血管通透性,湿干重比(W/D)法检测肺水肿程度,-酶联免疫吸测定(Ellisa)法检测血清及肺组织TNF-a,IL-1β,IL-6,人髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒检测肺组织MPO活性,支气管肺泡灌洗术(BAL)检测肺部多型核细胞数(PMNs),检测Tunel凋亡染色试剂盒检测肺组织细胞凋亡,蛋白免疫印迹法(western blot)检测肺部BAX及Bcl-xl蛋白表达,荧光试剂盒检测肺组织caspsse-3 活性。结果第一部分 虎杖苷对烧伤后血管通透性增高的影响1、药物剂量实验:假烧伤组大鼠生存时间均超过72小时;烧伤+生理盐水组大鼠平均生存时间为13.8±2.9小时;低、中、高剂量环孢霉素A组大鼠平均生存时间分别为10.7±4.0、14.8±3.0、10.6±2.9小时;低、中、高剂量白藜芦醇组大鼠平均生存时间分别为14.42±4.5、17.3±5.5、15.1±3.1小时;低、中、高剂量虎杖苷组大鼠平均生存时间分别为14.1士2.8、28.3±12.1、26.9±10.3小时。2、虎杖苷对烧伤后肠系膜血管通透性影响:各组烧伤大鼠平均动脉压在实验期间均处于正常范围。假烧伤组ΔI为0.25±0.06,生理盐水组则显著增加为0.55±0.07(P<0.01),环孢霉素A、白藜芦醇及虎杖苷治疗组ΔI分别为0.47±0.07,0.43±0.06 0.35±0.07,与生理盐水组比较,白藜芦醇组(p<0.05),及虎杖苷组(P<0.01)差异具有统计学意义。提示白藜芦醇及虎杖苷可以明显改善烧伤后血管通透性增加,尤其是虎杖苷效果更为显著。3、虎杖苷对烧伤后内在凋亡信号的影响:1)血清过氧化脂质(LPO)含量由假烧伤组的0.21±0.02μmol/L增加为生理盐水组的0.46±0.06μmol/L(P<0.01),环孢霉素A、白藜芦醇及虎杖苷治疗组分别为0.41±0.05μmol/L、0.33±0.04μmol/L,、0.28±0.04μmol/L,其中白藜芦醇组与虎杖苷组较生理盐水组差异显著(P<0.01)。血管组织中LPO含量与血清结果一致,烧伤后LPO含量显著增加,而保护剂治疗后LPO不同程度减少,虎杖苷效果最佳;2)蛋白免疫印迹结果显示在假烧伤组胞质cytochrome c及smac表达很少,而生理盐水组表达显著增加,三种药物治疗组中,cytochrome c及smac表达不同程度降低,以虎杖苷组最为明显;3)肠系膜血管caspase-3活性在生理盐水组明显增加(P<0.01),虎杖苷治疗组则显著下降(P<0.05)。4)免疫荧光染色可见在假烧伤组中,β-catenin主要沿着壁表达,光滑而整齐,而烧伤后,表达混乱并且扩散至血管内。药物治疗后,可见白藜芦醇及虎杖苷组血管内β-catenin表达减少,其中虎杖苷组改善情况最显著,基本恢复到正常。4、虎杖苷对烧伤局部血管通透性影响:假烧伤组血管通透性系数Pa为4.3±1.8,烧伤后显著增加为7.9±2.6(P<0.01),虎杖苷治疗后降低为5.2±1.2(P<0.05)。第二部分 虎杖苷对烧伤后肺损伤的保护作用1、虎杖苷对烧伤后肺损伤病理及肺水肿的影响:1)HE染色见假烧伤组肺部结构清晰,无炎性细胞浸润。烧伤后肺泡结构破坏,大量中性粒细胞浸润,肺泡壁增厚,而虎杖苷组仅见少量中性粒细胞浸润,肺泡结构较完整;2)伊文思蓝(EB)实验结果显示烧伤后肺组织EB含量由假烧伤组的11.84±1.88μg/100 mg干组织明显增加为24.00±5.22μg/100 mg干组织(P<0.01),虎杖苷治疗后降低为17.66 ± 2.99μg/100 mg干组织(P<0.01)。3)烧伤后肺湿干重比由3.62±0.33增加为4.83±0.38(P<0.01),虎杖苷组为4.00±0.25,较生理盐水组差异明显(P<0.05);3)烧伤后支气管灌洗液总细胞数及多型核细胞数(PMNs)分别由(0.49±0.2)105/ml 和(0.24±0.16)105/ml 增加为(9.53±2.11)105/ml 和(6.42±2.31)105/ml(P<0.01)。虎杖苷组则降低为(5.90±1.97)105/ml 和(3.79±1.73)105/ml(P<0.01)。2、虎杖苷对烧伤后肺部炎症反应的影响:1)烧伤后肺组织中提示中细粒细胞活性的髓过氧化物酶(MPO)活性明显增高,而虎杖苷显著抑制其增加;2)烧伤后血清 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 分别由 19±12.3 pg/ml、33±20.8 pg/ml 和 26±12.5 pg/ml 增加为 432±122.7、310±102.8 pg/ml 和 230±88.5 pg/ml(P<0.01),虎杖苷组分别为 229±66.8 pg/ml、194 士 60.8 pg/ml 和 150±48.7 pg/ml,较生理盐水组差异显著(P<0.01或P<0.05);3)肺组织TNF-α、IL-1β及IL-6分别由24 士7.4μg/mg 组织、13±4.2μg/mg 组织和 3 1±11.3μg/mg 组织增加为 332±68.5μg/mg组织、172±73.8μg/mg组织和188±65.2μg/mg组织,虎杖苷组显著改善为95 士22.6μg/mg组织、85±25.4μg/mg组织和 120±27.0μg/mg组织(P<0.01 或P<0.05)。3、虎杖苷对烧伤后肺组织细胞凋亡的影响:1)Tunel染色结果显示烧伤后肺部细胞凋亡增加,凋亡细胞数由每视野1.7±1.2增加到39.5±12.7(P<0.01),而虎杖苷则可减少细胞凋亡,细胞凋亡数为18.7±10.6(P<0.01);2)蛋白免疫印迹结果提示烧伤后肺组织BAX表达上调而Bcl-xl表达下调,虎杖苷则可明显抑制BAX和Bcl-xl表达改变;3)烧伤后caspase-3活性明显增加,而虎杖苷可明显抑制其活性增加(P<0.05)。4、虎杖苷对烧伤后大鼠生存时间的影响:烧伤后大鼠生存时间明显下降为30.2±11.6,48小时存活率为1/8(P<0.01),虎杖苷治疗后生存时间明显延长为50.7±17.0,48 小时存活率为 4/8(P<0.05)。结论1.烧伤后血管内皮细胞氧化应激,线粒体途径内在凋亡信号激活,血管通透性增加。2.虎杖苷可以明显降低烧伤引起的肠系膜微静脉血管通透性增加,其机制通过降低氧化应激,抑制内在凋亡信号。3.虎杖苷可以明显抑制烧伤局部血管通透性增加,机制尚需进一步研究。4.虎杖苷可以明显改善烧伤后肺损伤,延长烧伤后大鼠生存时间。5.虎杖苷通过降低肺部炎症反应,抑制肺部细胞凋亡改善烧伤后肺损伤。