背景冠状动脉粥样硬化性心脏病简称为冠心病(Coronary heart disease,CHD),临床上分为急性冠状动脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)和慢性心肌缺血综合征,不稳定性心绞痛(Unstable angina,UA)是ACS中的常见类型,它是在冠状动脉粥样硬化病变的基础上,发生了冠状动脉内膜下出血,斑块破裂,破损处血小板与纤维蛋白凝集形成血栓,导致冠状动脉痉挛以及远端小血管栓塞而引起的急性或亚急性心肌缺血所致。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)是机体中存在的,能特异性归巢于缺血损伤部位,并可进一步分化为血管内皮细胞(Endothelial cells,ECs)的一群前体细胞。大量研究显示,EPCs可促进血管新生,修复损伤内膜,在维持心血管系统稳定状态中起着重要作用,在冠心病的防治上有巨大的潜力。与正常人比较,冠心病患者外周血EPCs的数量在不同的病理生理阶段出现了不同的变化。在慢性缺血性综合征患者中,外周血EPCs的数量降低,这可能与冠心病的多项危险因素有关；在急性心肌梗死的患者中,外周血EPCs的数量增加,可能是严重的心肌缺血刺激机体,通过增加外周血EPCs数量,发展新生血管及侧支循环以维持心脏血流灌注所导致。而不稳定性心绞痛患者既存在慢性缺血性综合征患者的多项危险因素,又因其冠状动脉粥样斑块不稳定而易导致心肌缺血加重,因此冠状动脉的病变程度是否与外周血EPCs数量存在相关性,目前国内外相关的研究结果尚有争议。经皮冠脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)是目前治疗冠心病不稳定性心绞痛的重要手段,它可以重建稳定的冠脉血流,降低心脏功能损害的程度,从而改善预后及降低病死率,但PCI对EPCs的数量以及生物学功能的影响,目前国内外相关的报道较少。因此,我们通过对不稳定性心绞痛患者外周血EPCs的数量进行检测,并通过Gensini评分系统对不稳定性心绞痛患者冠脉病变的严重程度进行定量评分,然后与上述指标进行相关性分析,探讨它们的相关性；在此基础上,我们对符合PCI指征的不稳定性心绞痛患者进行了介入治疗,并观察PCI术后1周及6月患者外周血EPCs的数量,双阳性细胞的数量,细胞迁移能力、增殖能力等指标,并与单纯药物治疗的患者进行比较,进一步探讨经皮冠脉介入治疗是否对不稳定性心绞痛患者外周血EPCs的数量及生物学功能产生有利影响。希望通过我们的研究,为不稳定性心绞痛的诊断和治疗提供新的思路。目的1.通过检测不稳定性心绞痛患者外周血EPCs数量,结合Gensini评分系统对冠脉病变进行的定量评分,探讨冠脉病变的严重程度与外周血EPCs数量的相关性；2.探讨经皮冠脉介入治疗对不稳定性心绞痛患者外周血EPCs数量,双阳性细胞数量,细胞迁移能力、增殖能力的影响；3.探讨与单纯药物治疗比较,经皮冠脉介入治疗不稳定性心绞痛是否更有利于改善患者的外周血EPCs数量,双阳性细胞数量,细胞迁移能力、增殖能力。方法1.选取2011年1月～2012年6月在我院心血管内科住院并经冠脉造影确诊的,年龄在45-69岁的不稳定性心绞痛患者56例为研究对象,诊断符合中华医学会心血管病学分会制定的标准。所有患者均排除肿瘤、严重肝肾功能不全、急性脑血管意外、糖尿病等疾病,入院前均未服用血管紧张素转换酶抑制剂(Angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI),血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(Angiotensin II receptor blocker,ARB)及羟甲基戊二酸单酰辅酶A(3-Hydroxy-3-methyl glutarul coenzyme A,HMG-CoA)还原酶抑制剂等。2.冠状动脉狭窄程度评估采用Judkins法对所有患者行选择性冠状动脉造影术。根据Gensini评分系统对冠状动脉狭窄程度进行定量分析,评分方法为每段冠状动脉管腔狭窄的评分乘以各病变血管的权重系数,最后总评分为各段评分之和。3.冠脉造影及术后处理患者完成造影后分为两组,介入组30例行介入治疗,植入雷帕霉素药物支架,术后规范地按冠心病二级预防方案治疗,服用ACEI/ARB类药物、HMG-CoA还原酶抑制剂和抗血小板药物等进行治疗。药物组26例术后规范地按冠心病二级预防方案治疗。4.外周血EPCs数量、生物学功能的检测介入组及药物组在冠脉造影术前、术后1周及术后6月随访时完成下列检测。4.1流式细胞仪检测外周血EPCs数量使用乙二胺四乙酸(Ethylenedianine tetraacetic acid, EDTA)管抽取2ml静脉血,取人外周静脉血1001μl置于流式管中；加入藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)标记的鼠抗人KDR抗体,异硫氰酸荧光素(Flourescein isothiocyanate,FITC)标记荆豆凝集素1(FITC-UEA-1)标记的鼠抗人CD34抗体10μl,阴性对照管加入PE. FITC和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin, APC)标记的同型大鼠IgG抗体10μ1；4℃避光孵育30min；250g离心5min；弃去上清液,流式细胞检测缓冲液洗涤2次,4%多聚甲醛溶液重悬,流式细胞仪检测分别检测CD34+/KDR+阳性细胞(EPCs)。以105单个核细胞中含有CD34+/KDR+阳性细胞进行计数,其值以千分比表示。4.2EPCs培养与鉴定抽取外周血20ml,密度梯度离心法获取单个核细胞。贴壁细胞培养7d后,加入0.02mg/ml的DiI-acLDL溶液,37℃下孵育2h；用磷酸缓冲液(Phosphate buffer solution,PBS)冲洗2次；加入4%多聚甲醛溶液固定细胞15min；用PBS清洗2次；加入0.01mg/ml的FITC-UEA-1溶液,37℃下孵育1h；加入10μg/ml的4’6-二脒基-2-苯基吲哚(4’6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI)溶液,37℃下孵育5min。荧光倒置显微镜观察,DiI-acLDL(红色)和FITC-UEA-1(绿色)双染色阳性细胞(双阳性细胞)为EPCs。EPCs培养第7天后,在40倍显微镜下随机选3个视野进行计数,求平均值。4.3EPCs迁移能力检测将含50ng/mL血管内皮生长因子(Vascular endo-thelial growth factor,VEGF)的杜氏(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)培养液加入改良Boyden小室的下室,用2.5g/L胰酶消化贴壁细胞,悬浮于DMEM培养液中。将1×105个细胞悬浮在500μl DMEM培养液注入上室,培养24h后,刮去滤膜上面的未迁移细胞,用甲醇固定,Giemsa溶液染色,在400倍显微镜下随机选3个视野计数迁移细胞,求平均值。4.4EPCs增殖能力检测在EPCs培养了7天之后,先用2.5g/L的胰蛋白酶分离出贴壁细胞,再将细胞悬浮于预先制备好的DMEM培养液中。然后将相同数量的EPCs接种到人纤维连接蛋白包被的96孔培养板上,培养板每孔加10μl噻唑蓝(Methylthiazolyldipheny-tetrazolium bromide,MTT)(5g/L),经过4h的培养后,先去除上清液,然后加入二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(150μl/孔),并充分摇匀,10分钟后在酶标仪下在波长490nm处测吸光度值。结果：1.介入组与药物组基线资料比较：两组基线资料差异无统计学意义(P>0.05)。2.不稳定性心绞痛患者(所有研究对象)Gensini评分与外周血EPCs数量,的对比分析：Gensini评分与外周血EPCs数量呈正相关(r=0.713,n=56,P<0.01)。3.冠脉造影术后介入组外周血EPCs数量,双阳性细胞数量,细胞迁移能力、增殖能力的变化：3.1术后1周与术前比较术后1周外周血EPCs数量高于术前(0.57±0.04‰vs0.30±0.04‰),双阳性细胞数量高于术前(67.70±4.09vs39.90±3.94),细胞迁移能力高于术前(34.03±3.43vs22.90±3.68),增殖能力高于术前(0.67±0.04vs0.28±0.04),差异有统计学意义(P<0.01)。3.2术后6月与术前比较术后6月外周血EPCs数量高于术前(0.53±0.04‰vs0.30±0.04‰),双阳性细胞数量高于术前(53.90±4.13vs39.90±3.94),细胞迁移能力高于术前(30.60±4.00vs22.90±3.68),增殖能力高于术前(0.52±0.04vs0.28±0.04),差异有统计学意义(P<0.01)。4.冠脉造影术后药物组外周血EPCs数量,双阳性细胞数量,细胞迁移能力、增殖能力的变化：4.1术后1周与术前比较术后1周外周血EPCs数量高于术前(0.44±0.04‰vs0.30±0.04‰),双阳性细胞数量高于术前(48.92±3.55vs37.96±4.38),细胞迁移能力高于术前(27.12±3.91vs24.65±3.84),增殖能力高于术前(0.54±0.04vs0.29±0.03),差异有统计学意义(P<0.01)。4.2术后6月与术前比较术后6月外周血EPCs数量高于术前(0.45±0.04‰vs0.30±0.04‰),双阳性细胞数量高于术前(47.77±4.17vs37.96±4.38),细胞迁移能力高于术前(27.54±4.24vs24.65±3.84),增殖能力高于术前(0.46±0.04vs0.29±0.03),差异有统计学意义(P<0.01)。5.冠脉造影术后介入组和药物组外周血EPCs数量,双阳性细胞数量,细胞迁移能力、增殖能力变化的比较5.1介入组术后1周外周血EPCs数量高于药物组(0.57±0.04‰vs0.44±0.04‰),双阳性细胞数量高于药物组(67.70±4.08vs48.92±3.55),迁移能力高于药物组(34.03±3.43vs27.11±3.91),增殖能力高于药物组(0.67±0.04vs0.54±0.04),差异有统计学意义(P<0.01)；5.2介入组术后6个月外周血EPCs数量高于药物(0.53±0.046vs0.45±0.04‰),双阳性细胞数量高于药物组(53.90±4.13vs47.76±4.17),迁移能力高于药物组(30.60±4.00vs27.53±4.24),增殖能力高于药物组(0.52±0.04vs0.46±0.04),差异有统计学意义(P<0.01)。结论：1.不稳定性心绞痛患者外周血EPCs数量与冠状动脉病变程度呈正相关；2.不稳定性心绞痛患者药物治疗1周及6月后外周血EPCs数量,双阳性细胞数量、迁移及增殖能力增高；3.不稳定性心绞痛患者介入治疗1周及6月后外周血EPCs数量,双阳性细胞数量、迁移及增殖能力增高,与单纯药物治疗比较增高的幅度更为显著。