论文部分内容阅读
2,3-丁二醇作为微生物中一种重要的初级代谢产物,广泛存在于自然界不同生境中。2,3-丁二醇的合成代谢主要涉及三个酶:α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶及2,3-丁二醇脱氢酶。传统观点认为2,3-丁二醇的分解代谢主要涉及2,3-丁二醇脱氢生成乙偶姻以及乙偶姻裂解两个关键步骤。然而2,3-丁二醇包括三种手性异构体:(2R,3R)-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇以及meso-2,3-丁二醇;乙偶姻包括两种手性异构体:(3R)-乙偶姻与(3S)-乙偶姻。只有从手性角度揭示2,3-丁二醇脱氢以及乙偶姻裂解过程,才能真正阐明2,3-丁二醇的分解代谢机制。课题组前期证实环境微生物标准菌株Pseudomonas putida KT2440可以代谢2,3-丁二醇的三种手性异构体,鉴定了三种手性2,3-丁二醇脱氢生成乙偶姻的关键酶。因而本论文第一部分研究目标为揭示手性乙偶姻的裂解机制,同时分析2,3-丁二醇分解代谢的调控机制。通过比较基因组学分析,发现P.putid KT2440中存在1个乙偶姻代谢基因簇,包括6个基因:acoR、acoX、acoA acoB、acoC以及bdh。首先对该基因簇中各个基因进行敲除及后续生理功能验证,首次证实acoX与bdh的敲除对乙偶姻利用无影响,其他基因敲除造成P.putida KT2440乙偶姻利用能力的丧失。然后对乙偶姻裂解关键酶酶AcoAB进行外源表达与分离纯化,确定AcoA及AcoB两个亚基对AcoAB的生化功能缺一不可,手性催化分析首次确定P putida KT2440中AcoAB可催化(3RR)-乙偶姻与(3S)-乙偶姻的裂解。接下来对P.putida KT2440中2,3-丁二醇分解代谢的调控机制开展研究,发现乙偶姻代谢基因簇中基因均为诱导型表达,基因acoX、acoA、acoB、acoC及bdh共转录,而调控基因facoR单独转录;通过5’RACE实验确定了acoX与acoRR的转录起始位点;证实2,3-丁二醇分解代谢关键酶的表达依赖于转录激活蛋白AcoR与σ54,首次发现AcoR在激活乙偶姻操纵子转录同时抑制自身转录;另外尽管2,3-丁二醇三种手性异构体均能诱导乙偶姻代谢基因簇的表达,本论文首次确定AcoR的真正效应分子为2,3-丁二醇脱氢产生的(3RR)-乙偶姻与(3S)-乙偶姻。NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶(L-iLDH)广泛存在于细菌、酵母及原生生物中,参与不同生命体的L-乳酸代谢。对不同的假单胞菌中L-乳酸代谢相关蛋白进行比较基因组学分析,在Pseudomonasstutzeri A1501中发现了 一种新型L-iLDH。实验室前期工作中已对该蛋白进行了外源表达与分析纯化,研究了其基本酶学性质,确定了与已报道的FMN依赖的L-iLDH不同,该新型L-iLDH是一个由三种不同亚基组成的二聚体LldABC,可能是以Fe-S簇为辅因子。本论文第二部分研究目标为揭示该新型L-iLDH中三种不同亚基的生物学功能,证实Fe-S簇在催化L-乳酸氧化中的关键作用。对P.stutzerP A1501中LldABC的三个亚基编码基因分别进行了敲除及后续生理功能验证,结果表明三个亚基对菌株利用L-乳酸缺一不可。对LldB亚基敲除菌株分别回补P.stutzee.A1501中的lldBBC基因及P.stutzeri SDM中的FMN依赖的L-iLDH基因lldD,两株回补菌株对L-乳酸的利用无区别。对LldABC的LldA及LldB亚基中Fe-S簇结合位点的进行定点突变并构建相应蛋白质表达菌株,首次确定了 Fe-S簇在LldABC催化L-乳酸氧化中的关键作用。另外,对三个亚基LldA、LldB与LldC分别进行了外源表达纯化,为后续研究LldA、LldB与LldC间的相互作用,揭示LldABC的具体催化机理奠定了基础。