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目前代谢工程的相关研究,主要是通过构建单一工程菌株合成目标产物。虽然这种利用单一微生物工程菌株合成目标产物的研究已取得很大的进展,然而进一步提高合成效率或合成更复杂的化合物亟需新的工程策略。为了突破单一工程菌代谢调控的局限性,越来越多的研究者开始关注于多工程菌共培养的生物合成方法。相比工程菌株单培养,共培养生物合成的方法具有以下优点:1)降低工程菌株的代谢负荷;2)为不同基因提供不同的细胞表达环境;3)将不同的代谢模块在空间上进行阻隔,可消除或降低这些代谢模块之间的不良影响;4)有利于每个代谢模块生物合成效率的独立调控;5)可通过不同代谢模块之间的更换,实现不同产物的高效合成;6)有利于同时利用多种底物等。本文通过对莽草酸代谢路径进行优化,包括删除竞争代谢路径的相关基因,过表达关键酶的表达基因,引入解除反馈抑制的酶和中间代谢物转运蛋白等一系列代谢工程操作,构建了以不同中间代谢物作为节点的4-羟基苯甲酸生物合成共培养体系。在此基础上,引入了 4-羟基苯甲酸作为信号分子的pobR-PpobR-PpobA-tetA生物传感系统,以促进工程菌株持续性筛选高产4-羟基苯甲酸的细胞亚群。在所有构建的共培养体系中,P5.3D:BH2.9R合成的4-羟基苯甲酸的产量最高。其中,上游菌是在E.coli K12的基础上,删除了染色体上aroE和ydiB,并过表达了aroGfbr 基因,以促进DHS的高效合成;下游菌是在E.coli BL21（DE3）的基础上,删除染色体上的tyrA和pheA,过表达aroE、aroK、aroL、aroA、aroC、ubiC和shiA,并引入pobR-PpobR-PpobA-tetA生物传感系统所得。在试管水平上,该共培养体系可合成325 mg/L 4-羟基苯甲酸,产率为0.065 g/g葡萄糖。引入pobR-PpobR-PpobA-tetA生物传感系统后,4-羟基苯甲酸的产量提高了 193%。其次,以合成4-羟基苯甲酸的工程菌株为上游菌,并与具有4-羟基苯甲酸-苯酚合成能力的下游菌组合成共培养体系合成苯酚。通过过表达相关酶基因,筛选上下游菌株,引入持续性筛选高产细胞亚群的生物传感系统等一系列代谢工程操作,最终获得高产苯酚的共培养体系UY3R:DY2-R。该共培养体系中,上游菌UY3R是在BL21（DE3）的基础上,删除了染色体上的tyrA和pheA,过表达aro Gfbr、aroB、aroD、aroE、aroL、aroA、aroC和ubiC这几个合成4-羟基苯甲酸的关键基因,并引入以4-羟基苯甲酸作为信号分子的pobR-PpobR-PpobA-tetA生物传感系统;下游菌DY2-R是在BL21（DE3）的基础上,删除了染色体上的tyrA和pheA,引入来源于E.coli W的yclBCD基因,并引入以苯酚作为信号分子的dmpR-Pr-Po-tetA生物传感系统。其中,dmpR-Pr-Po-tetA生物传感系统可促进工程细胞持续性筛选高产苯酚的细胞亚群。该共培养体系在试管水平可合成403 mg/L苯酚,产率为0.081 g/g葡萄糖。上游菌引入pobR-PpobR-PpobA-tetA生物传感系统后,苯酚的产量提高了 68%;进一步在下游菌中引入dmpR-Pr-Po-tetA生物传感系统后,苯酚的产量又提高了 41%。此外,将上述苯酚生物合成共培养体系的下游菌更换成具有4-羟基苯甲酸-原儿茶酸和4-羟基苯甲酸-对苯二酚生物合成能力的下游菌,从而组合成分别能合成原儿茶酸和对苯二酚的新共培养体系。其中,原儿茶酸的生物合成通过在下游菌中引入来源于Pseudomonas aeruginosa的4-羟基苯甲酸羟化酶（PobA）来实现,在试管水平可合成641 mg/L原儿茶酸,产率为0.128 g/g葡萄糖。对苯二酚的生物合成通过在下游菌中引入来源于Candidaparapsilosis CBS604的4-羟基苯甲酸1-羟化酶（MNX1）来实现,在试管水平可合成303 mg/L对苯二酚,产率为0.061 g/g葡萄糖。同样的上游菌,通过和不同的下游菌组合,即可合成苯酚、原儿茶酸和对苯二酚这三种不同的化合物。通过不同工程菌株的不同组合,来合成不同化合物的这一特点,节约了菌株构建成本,也反应了合成生物学的模块化的理念。综上所述,本论文首次将高产细胞亚群的筛选机制与共培养生物合成的优势相结合,构建了合成4-羟基苯甲酸、苯酚、原儿茶酸和对苯二酚的共培养体系。这一研究方法有望为代谢工程领域提高生物合成效率提供一种新思路。为了对比共培养和单培养生物合成的效率,以及比较生物传感系统分别在共培养和单培养生物合成中的应用潜力,每个共培养体系都构建了同等代谢工程操作的单培养对照菌株。实验结果证明,对于简单体系而言,共培养体系生物合成的方法并没有比单培养菌株有优势,或者优势不显著。而随着代谢工程操作的增加,过高的代谢负荷对单培养菌株的影响较大,共培养体系的生物合成效率显著高于单培养菌株。此外,具有高产细胞亚群筛选机制的生物传感系统的应用,能显著提高共培养体系的生物合成效率。其中,以中间代谢物为信号分子的生物传感系统,因能提高共培养体系上游菌的生物合成效率,从而提高终产量。而对于单培养菌株而言,此类传感系统可能会筛选出低消耗中间产物的细胞亚群,从而降低整体的生物合成效率。因此,以中间代谢物为信号分子的生物传感系统不适用于单培养体系。以终产物为信号分子的生物传感系统,能提高共培养体系下游菌的生物合成能力,从而提高共培养体系的整体产量。此类传感系统也能提高单培养菌株的产量,但当单培养菌株涉及的合成路径较复杂时,引入生物传感系统会进一步加大细胞的代谢负荷,同时降低筛选效率,从而使菌株的产量下降。最后,为了验证共培养体系是否能稳定进行放大培养,本论文选取合成苯酚的共培养体系UY3R:DY2-3,进行了摇瓶培养、发酵罐流加培养、发酵罐双相萃取流加培养的放大实验。最终,以三丁酸甘油酯为萃取剂进行双相萃取流加培养,可利用40g葡萄糖合成2.094g苯酚,产率为0.053 g/g葡萄糖。不同水平培养的结果对比显示,除单相发酵罐流加培养因苯酚对细胞生长的抑制作用,导致其产率较低（0.023 g/g葡萄糖）,其它水平培养所获得的产率相对稳定。试管培养、摇瓶培养和发酵罐双相萃取流加培养所获得的产率分别为0.057 g/g葡萄糖、0.061 g/g葡萄糖和0.053g/g葡萄糖。证明了共培养体系进行生物合成可有效地进行放大培养,为今后共培养体系生物合成的实际应用打下了坚实的基础。